MATERIALES Y METODOS
Se utilizó el suero proveniente de la Planta de Lácteos de la Facultad de Ciencias Veterinarias UCV, ubicada en la ciudad de Maracay-Edo. Aragua. El cultivo usado en la fermentación fue la levadura Kluyveromyces lactis, cepa N° 30.841, donada por el cepario del Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel". Las células de esta levadura fueron mantenidas en cuñas de 2% de agar y 1% de extracto de malta a 4ºC, con transferencias mensuales.

Preparación del suero desproteinizado
Para lograr separar las proteínas del suero se aplicó un tratamiento termoácido, el cual consistió en ajustar el pH a 4,6 con ácido acético y posteriormente aplicar calor (90°C por 15 minutos), para así precipitar las proteínas y además pasteurizar el medio. El suero se dejó reposar, luego se realizó una filtración al vacío utilizando papel de filtro (Wathman N°1) y se conservó refrigerado.

Análisis químicos del suero desproteinizado
Al suero desproteinizado se le determinó la humedad, acidez, pH y nitrógeno total, según los métodos descritos en el A.O.A.C (9). La lactosa se determinó mediante el método de Somoghy (10).

.- Suplementación del medio de cultivo:
El suero fue suplementado con la adición de 0,15% de extracto de levadura y 0,1% de (NH₄ )₂ SO₄, según lo recomendado por Sánchez y Castillo (3).

.- Inóculo:
El medio usado para preparar el inóculo fue el suero desproteinizado y suplementado. Se colocaron 140 ml de este suero en fiolas de 500 ml, se le ajustó el pH a 5 y se esterilizó a 120°C x 10 min. Una vez enfriado se le agregó el contenido celular crecido, durante 24 horas a 30˚C en cuña de agar/extracto de malta, arrastrado con 10 ml de caldo extracto de malta; las fiolas se incubaron a 30°C por 18 horas, con agitación, esto garantizó una población microbiana alrededor de 10 ⁷ células/ml.

.- Condiciones del cultivo:
En el proceso de producción de la lactasa, se utilizó un fermentador marca New Brunswick modelo BioFlo 2000 modular con una capacidad de 2 l. Para lo cual 1350 ml de suero desproteinizado y suplementado se esterilizaron a 120°C x 10 min., en el mismo recipiente del fermentador, posteriormente se le agregó 150 ml de inóculo, obteniendo un volumen total de trabajo de 1,5 l. Las variables a considerar fueron: pH, temperatura, velocidad de agitación y tiempo de fermentación a una tasa de aireación de 0,5 vvm. Se utilizó un diseño factorial de dos niveles, para los cuatros factores antes mencionados, es decir un factorial 2⁴ . Con la finalidad de describir la naturaleza de la superficie de respuesta en la región del óptimo, se utilizó un diseño compuesto central ortogonal empleando cinco niveles de cada factor (-a , -1, 0, 1 y a ), como lo describe la literatura revisada (11); el cual básicamente consistió en un diseño factorial 2^k , donde k=4 (2⁴ =16), con ocho puntos estrellas 2k (2x4=8) y seis (6) repeticiones de los puntos centrales (N^o=6), dando un total de treinta (30) tratamientos, los cuales siguieron el orden establecido en la matriz de diseño codificada que se muestra en la Tabla 1. En la Tabla 2 se muestran los valores reales de pH, temperatura (°C), velocidad de agitación (r.p.m.) y tiempo de fermentación (horas), para poder establecer las condiciones de trabajo para cada tratamiento, los rangos de las variables empleadas, se establecieron de acuerdo a la literatura revisada siendo los siguientes: temperatura: 27 – 35°C, pH: 4 –7, velocidad de agitación: 100 – 200 r.p.m y tiempo de fermentación: 12 – 24 horas.

TABLA 1
Matriz del Diseño Compuesto Central Ortogonal a utilizar en la optimización del proceso
de producción de lactasa por Kluyveromyces lactis en suero desproteinizado

TABLA 2
Tratamientos utilizados en el establecimiento del Diseño Compuesto Central Ortogonal para la
optimización del proceso de producción de lactasa por
Kluyveromyces lactis en suero desproteinizado

Ensayo de actividad enzimática y determinación de proteína
Los ensayos de actividad enzimática se realizaron según la metodología indicada por Sánchez y Castillo (3), utilizando ONPG como sustrato. La actividad enzimática fue definida como la cantidad de enzima necesaria para producir un m mol de ONP en 1 min., bajo las condiciones descritas. El contenido proteico del extracto enzimático se llevó a cabo mediante el método colorimétrico de Lowry et al.,(12), utilizando albúmina de suero de bovino.

Extracción de la enzima
Las células cosechadas por centrifugación (10.000 r.p.m por 10 min.) y lavadas con agua destilada, fueron resuspendidas en buffer fosfato de potasio 0,1 M pH 7, suplementado con 0,5 mM MgSO₄ y 0,1 mM MnCl_2; a esta suspensión se le adicionó tolueno al 2% (v/v) como solvente orgánico, durante 16 horas a 37 °C para causar la permeabilización de las células (13).

Purificación de la enzima
Se realizó una purificación parcial de la enzima, como lo describen Goncalves y Castillo (1) una vez incubada la suspensión con tolueno 2% (v/v), ésta se centrifugó a 10.000 r.p.m. x 20 min., descartándose el precipitado. Un volumen igual de acetona se adicionó al sobrenadante a 4°C, el precipitado formado se colectó por centrifugación a 10.000 r.p.m. x 20 min., y luego de la evaporación de la acetona residual fue disuelto en el buffer fosfato de potasio 0,1 M utilizado en la extracción. A esto se le denominó extracto purificado.

Efecto de la temperatura y el pH sobre la enzima
Se estudió el efecto del pH en un rango de 5 a 8 y de la temperatura en un rango de 30 a 60°C, sobre la actividad enzimática, a través de la metodología descrita por Sánchez y Castillo (3), utilizando también ONPG como sustrato.

Análisis estadísticos
La variable respuesta analizada fue la actividad enzimática de los extractos crudos obtenidos en los distintos tratamientos; esta variable se analizó siguiendo los pasos de la Metodología de Superficie de Respuesta:

.-Análisis de varianza:
Se utilizó para establecer si existen diferencias o no entre los tratamientos y también para determinar la variabilidad debida al error experimental.

.-Análisis de la regresión:
Para los efectos lineales, cuadráticos y cruzados de los factores que tuvieron influencia sobre la variable respuesta.

.-Establecimiento del modelo de regresión:
Para establecer el modelo de regresión de la variable respuesta, se consideraron los coeficientes de regresión estimados en el análisis de regresión.

.-Análisis canónico de la superficie de respuesta:
Para caracterizar la superficie en la vecindad inmediata del punto estacionario, es decir determinar si éste es un punto de respuesta máxima, mínima o punto de silla.

.-Análisis de Ridge:
En caso tal que el punto estacionario resultó ser un punto de silla, este análisis permitió estimar los niveles de cada factor para obtener la respuesta óptima.

RESULTADOS Y DISCUSION
Caracterización química del suero desproteinizado
El suero desproteinizado empleado como sustrato de la fermentación fue analizado para determinar su composición (Tabla 3); se encontró que presenta un 93,83% de humedad, 6,17% de sólidos totales, 0,44% de proteína, 4,85% de lactosa, 0,43% de acidez y un pH de 4,58. El contenido de humedad fue inferior y el de sólidos totales y proteína mayor, a los encontrados por otros autores en permeado de suero dulce (14,15) y en suero desproteinizado (5). No obstante el contenido de lactosa aunque es similar al indicado en permeado de suero dulce (14), es inferior al reportado en suero desproteinizado (5). Estas diferencias pueden deberse tanto a la técnica utilizada en la separación de proteínas, como a la materia prima, ya que autores utilizan la ultrafiltración y permeado de suero dulce (14) mientras que otros la termocoagulación y suero reconstituido en una proporción de 60 g/L (5). Con respecto al pH, se observan valores similares a los reportados por la literatura revisada (5,15), no así la acidez, la cual tuvo un valor intermedio a lo informado en la mencionada literatura (5,15) quizás esta diferencia es debida a la acidificación sufrida por el suero durante el proceso de separación proteica.

TABLA 3
Caracterización química del suero desproteinizado

Optimización del proceso de producción de b -galactosidasa por Kluyveromyces lactis, aplicando la metodología de Superficie Respuesta y utilizando un Diseño Compuesto Central Ortogonal
Una vez realizadas las 30 pruebas establecidas en el diseño experimental que se mostró en la Tabla 2, se obtuvo el extracto enzimático correspondiente a cada tratamiento, al cual se le procedió a determinar la actividad enzimática (U/ml), concentración proteica y actividad enzimática específica (U/mg), los resultados se muestran en la Tabla 4. Los valores de actividad enzimática, concentración proteica y actividad enzimática específica de los extractos en los diferentes tratamientos, estuvieron comprendidos entre 1,29 y 7,43 (U/ml), 0,68 y 1,84 (mg/ml) y entre 0,82 y 7,72 (U/mg), respectivamente; siendo estos valores similares a los encontrados por otros autores (17) con esta misma levadura, pero inferiores a los reportados con las levaduras Kluyveromyces fragilis (3,13) y Kluyveromyces marxianus (1). Al parecer la producción de lactasa, utilizando suero de leche desproteinizado como medio de fermentación, es mayor por las levaduras K. fragilis y K. marxianus, que por la levadura bajo estudio, por supuesto esto está vinculado a las condiciones de temperatura, velocidad de agitación del medio y tiempo de fermentación, utilizadas en cada investigación.

TABLA 4
Actividad enzimática, concentración proteica y actividad
enzimática específica de los extractos enzimáticos

Análisis estadísticos
.- Análisis de varianza
De acuerdo al análisis de varianza, se observa que existen diferencias altamente significativas entre los tratamientos, es decir los cambios observados en la cantidad de enzima producida, se deben a los tratamientos, por lo cual se justifica la optimización de las condiciones del proceso a través de esta variable respuesta. Además los valores de la respuesta presentaron una moderada variabilidad con un coeficiente de variación de 25,2%, lo cual es de esperarse en este tipo de ensayo donde son muchos los factores a controlar. En cuanto a la regresión, ésta también es altamente significativa así como los efectos lineales de temperatura, pH, velocidad de agitación y tiempo de fermentación; sin embargo se aprecia que los efectos cuadráticos puros y cuadráticos cruzados son significativos, es decir que todos o algunos de estos factores considerados están relacionados con la variable respuesta. El coeficiente de regresión (R²) fue de 0,8715 lo cual indica confiabilidad en la respuesta estimada, debido a que el 87,15% de los valores se ajustan al modelo de regresión planteado. La falta de ajuste resultó altamente significativa, lo que indica un sesgo en la respuesta estimada, es decir que algunos efectos importantes pudieron no haber sido considerados en el modelo polinominal cuadrático y/o que otras variables independientes necesitan ser incluidas en el modelo. Esto puede estudiarse a futuro.

.-Análisis de regresión:
A través de este análisis se observa que el efecto lineal de la temperatura es altamente significativo, mientras el resto no son estadísticamente significativos en la variable respuesta. En los efectos cuadráticos se aprecia que la temperatura y el pH son altamente significativos no así la velocidad de agitación y el tiempo de fermentación. Los efectos cuadráticos cruzados no son estadísticamente significativos, a excepción del efecto cruzado de la velocidad de agitación y pH, que sí es altamente significativo, esto debido a que la velocidad de agitación está relacionada con la velocidad de transferencia de oxígeno, la cual afecta el metabolismo celular, alterándose el pH.

.- Establecimiento del modelo de regresión:
De acuerdo a los coeficientes de regresión estimados, el modelo de regresión completa sería:

Act. Enzimática = -271,56 + 17,37 X₁ + 4,87 X₂ + 0,21 X₃ - 1,65 X₄ - 0,30 X₁² - 1,16 X₂² - 0,00001 X₃² - 0,007 X₄ ² + 0,28 X₁ X₂ - 0,0033 X₁X₃ + 0,0126 X₁X₄ - 0,032 X₂ X₃ + 0,156 X₂ X₄ + 0,0044 X₃ X₄

.- Análisis Canónico de la Superficie de Respuesta:
En la Tabla 5 se presentan los valores críticos de los factores con los cuales se obtiene el valor de la actividad enzimática en el punto estacionario o crítico, siendo este de 8,61 U/ml, que se logra bajo las condiciones de 28,67°C, pH 2,53, 181,08 r.p.m., las cuales se encuentran dentro de los rangos estimados en el diseño experimental, a excepción del tiempo, el cual se sale del rango estimado. Los autovalores muestran que el punto estacionario es un punto de silla o de máximo-mínimo ya que dichos valores fueron de diferentes signos. Debido a esto se realizó seguidamente el análisis de Ridge para la respuesta máxima y mínima, este análisis permitir estimar la respuesta óptima de la actividad enzimática y los niveles de los factores considerados para lograr esa respuesta.

TABLA 5
Valores críticos obtenidos mediante el análisis canónico de la Superficie de
Respuesta para la variable actividad enzimática de los extractos enzimáticos

.- Análisis de Ridge:
El análisis de Rigde conlleva a la optimización del proceso con respecto a la actividad enzimática, cuando se obtiene un punto silla o de máximo y mínimo. En este caso el interés es encontrar los niveles de los factores en los cuales se obtiene una mayor actividad enzimática (8,25 U/ml), siendo estos: temperatura 30,3°C, pH 4,68, velocidad de agitación 190,76 r.p.m y tiempo de fermentación 18,55 h, sin embargo para efectos de operación del equipo y trabajo en el laboratorio, la velocidad se ajustó a 191 r.p.m y el tiempo a 18,5 h, lo cual no afectó la variable respuesta. Los valores de temperatura y pH encontrados a través de este análisis coinciden con los señalados en la bibliografía en la producción de esta enzima por levaduras (1,3,16-18), sin embargo no hay concordancia entre la velocidad de agitación y el tiempo de fermentación indicado entre estos autores. En este sentido autores han señalado con la misma levadura bajo estudio, el uso de 80 r.p.m. por un tiempo de 56 a 70 h (17) hasta 200 r.p.m. x 10 h (19). Otros autores con la levadura K. fragilis han indicado la utilización de 120 r.p.m. x 24 h (3), hasta 175 r.p.m. x 18 h (13,16). Con K. marxianus algunos autores reportan 400 r.p.m., sin considerar el tiempo de agitación utilizado (1) y otros señalan 200 r.p.m. x 10 h (18); es de hacer notar que esta variabilidad entre la velocidad de agitación y el tiempo de fermentación utilizado depende de la geometría del equipo empleado. Así mismo cabe resaltar que se ha logrado optimizar a través de la MSR, la composición de un medio de cultivo, para Kluyveromyces fragilis, utilizando en la fermentación una temperatura de 30˚C y 130 r.p.m. durante un tiempo de 14 h, reportándose una actividad enzimática de 6,51 U/ml (20).

Purificación del extracto enzimático
En la Tabla 6 se muestran los resultados obtenidos en el proceso de purificación del extracto crudo de la enzima. Se puede apreciar que se obtuvo un menor rendimiento (50,8%), pero más pureza (7,4 veces), en comparación con lo encontrado con este mismo solvente, por otros autores con Kluyveromyces fragilis, (13) (97% y 2,74 veces de purificación), no obstante en nuestro trabajo se encontró mayor rendimiento y pureza a lo reportado con K. marxianus (1).

TABLA 6
Purificación del extracto enzimático

Temperatura y pH óptimos de la lactasa producida por Kluyveromyces lactis
Los resultados obtenidos en la determinación de la temperatura óptima de la enzima se muestran en la Figura 1. De acuerdo a estos resultados, la mayor actividad enzimática (46,6 U/ml) ocurre a la temperatura de 60°C. Este valor es similar al encontrado por otros autores con la misma levadura bajo estudio (17), pero es aproximadamente 10˚C mayor a lo indicado en lactasa producida por otras levaduras (1,3,18). Con este valor de temperatura óptima se llevo a cabo la determinación de pH óptimo. Con respecto al pH se puede notar en la Figura 2, que el valor de mayor actividad enzimática (67,2 U/ml) ocurre a un pH de 6,2, lo cual coincide con la literatura revisada en lactasa producida por KLuyveromyces fragilis (3) y Kluyveromyces marxianus (1); aunque es menor al señalado por otros autores con esta última levadura (pH 7) (18). Estas diferencias entre las temperaturas y pH óptimos, parecieran intrínseco a la cepa utilizada en la producción de la enzima.

FIGURA 1
Efecto de la temperatura sobre la actividad de la
b -galactosidasa producida por Kluyveromyces lactis

FIGURA 2
Efecto del pH sobre la actividad de la b -galactosidasa
producida por Kluyveromyces lactis

AGRADECIMIENTO
Los autores expresan su reconocimiento al Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico (C.D.C.H), por el financiamiento de esta investigación (Proyecto N˚01.37.4108.98).

CONCLUSIONES
El suero lácteo desproteinizado sirvió como base para la formulación de un medio de cultivo para levaduras capaces de hidrolizar la lactosa, debido a que presenta en promedio un contenido de lactosa de 4,85%.

En la optimización del proceso de producción de la b -galactosidasa por Kluyveromyces lactis, a partir de éste sustrato se pudo establecer como condiciones óptimas las siguientes: temperatura 30,3°C; pH 4,68; velocidad de agitación 191 r.p.m. y un tiempo de fermentación 18,5 h., notándose a través del análisis de regresión, que la temperatura fue el factor que más influyó en la producción de enzima por la levadura Kluyveromyces lactis.

El análisis canónico detectó que el punto crítico era un punto de silla, y mediante el análisis Ridge se logró optimizar la variable respuesta, que era la actividad enzimática.

La purificación parcial de la enzima con acetona, condujo a un rendimiento de 50,8% y una purificación de 7,4 veces del extracto enzimático.

La temperatura óptima de la enzima purificada fue alta (60°C), por lo cual esta enzima puede ser usada en productos lácteos pasteurizados, debido a que se incrementaría la hidrólisis de la lactosa, igualmente el pH de la enzima purificada fue de 6,2, lo cual favorece el uso de esta enzima en la hidrólisis de la lactosa en leche y productos lácteos que tienen un pH similar.

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