Las semillas de canavalia tienen un 30% de contenido de proteínas y un 60% de carbohidratos que la coloca como una importante fuente de gran valor energético y proteico (5). Es considerada como una planta rústica con altos rendimientos de granos y forraje capaz de proveer alimentos en áreas marginales, donde el cultivo de otras leguminosas no tendría éxito (6). A pesar de las ventajas aparentes de esta especie para la producción de proteínas en los trópicos, la utilización de la canavalia ha sido limitada, debido a la presencia de ciertos factores antinutricionales, entre los que se encuentran los inhibidores de proteasas, de α-amilasas, lectinas y aminoαcidos no proteicos como la L-canavanina, que reducen la calidad nutricional de las proteínas (7,8).

Es conocido el efecto positivo de algunos tratamientos como el remojo, cocción y el tostado para mejorar la calidad nutricional de la harina de las semillas de canavalia, aumentando su digestibilidad y disminuyendo los factores antinutricionales (7,8,9). En las últimas décadas se ha desarrollado la extrusión, como un método versátil, rápido y eficiente en la reducción de factores antinutricionales y en el aumento de la digestibilidad proteica (10). El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto de la extrusión sobre la actividad de factores antinutricionales y la digestibilidad in vitro de proteínas y almidón en la harina de granos de Canavalia ensiformis.

MATERIALES Y METODOS
Materiales
Las semillas de Canavalia ensiformis, analizadas, corresponden al genotipo Original, las cuales fueron suministradas por la Facultad de Agronomía de la Universidad Central de Venezuela, Maracay. Un lote de éstas semillas se molió en un molino Arthur Thomas a 60 mesh (0,25 mm). Una porción de esta harina (5 Kg) fue sometida al proceso de extrusión en un extrusor semi-industrial marca The Bonno, modelo 2 ½, bajo las siguientes condiciones: humedad de la harina cruda 20%; temperatura 155° C; velocidad del tornillo 75 rpm; velocidad de alimentación 205 g/min. El producto obtenido de la extrusión fue molido para obtener la harina extruida.

Métodos
Extracción de las proteínas: Las proteínas solubles fueron estraídas, agitando un gramo de harina cruda o extruida en 10 ml de agua destilada durante 24 h a 4° C. Posteriormente la mezcla fue centrifugada a 10.000 rpm por 10 min. El sobrenadante se almacenó en frío para los ensayos.

Extracción de los almidones: Se procedió según el método de Sathe y Salunkhe (11).

Determinación de proteínas: La concentración de proteínas solubles fue determinado por el método de Lowry y col. (12), usando albúmina sérica bovina como patrón. El contenido de nitrógeno se determinó por el método micro-Keldhal (13), y el contenido de proteína total fue calculado multiplicando el nitrógeno obtenido por el factor 6,25.

Determinación de almidón: La concentración de almidón en las harinas, fue determinado por el método de Theander y Westerlund (14). Donde el almidón fue digerido con una amilasa termo estable de origen bacteriano (Termamyl) y la enzima amilo-glucosidasa (EC 3.2.1.3).

Factores antinutricionales: a) Inhibidor de tripsina: La actividad inhibitoria de tripsina se determinó por el método de Kakade y col. (15), usando benzoil-DL-arginina-p-nitroanilida (BAPNA) como sustrato. b) Inhibidor de quimotripsina: La actividad inhibitoria de la quimotripsina fue determinado por el método descrito por Kakade y col. (16), utilizando como sustrato caseína al 2%. c) Inhibición de a -amilasa: La actividad inhibitoria de la a -amilasa se determinó por el método de Bernfeld (17). d) Título hemaglutinante: Se realizó por el método señalado por Jaffé y Brucher (18), utilizando eritrocitos lavados de sangre de conejo sin tratamiento enzimático previo y pre-tratados con pronasa y tripsina. e) Canavanina: Se determinó por el método colorimétrico de Rosenthal (19), usando el reactivo pentacianoaminoferrato al 1%.

Digestibilidad proteica in vitro: Se procedió según el método de Akenson y Stahmann (20), utilizando la caseína como proteína patrón. Suspensiones de almidón de papa (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), la cual fueron cocida durante 20 min en baño maría, fueron ensayados como referencia. La digestibilidad fue calculada mediante la ecuación:

% Digestibilidad = N digerido/N total x 100

Digestibilidad del almidón in vitro: Se realizó mediante el método de Singh y col. (21), utilizando amilasa pancreática porcina y midiendo la maltosa liberada. La digestibilidad fue calculada mediante la ecuación:

% Digestibilidad = (Maltosa liberada (mg) x 0,9 x 15 ml)/(120 mg de almidón x 0,2 ml) x 100

Tratamiento de diálisis: Se prepararon suspensiones mezclando la harina cruda y extruida con agua destilada en una proporción 1:20 (harina:agua), las cuales fueron colocadas en membrana de diálisis de celulosa natural, dializándose contra agua destilada por 72 h con 8 cambios de agua.

Análisis estadísticos: Los resultados fueron dados como la media ± desviación estándar, donde se usó la Prueba t student para comparar las medias de la harina cruda y tratada, utilizando el programa Number Cruncher Statistical System (Versión 4,22) para Computadoras IBM, elaborado por Jerry L. Hintze, Kaysville, Utah, 1986. La diferencia de significación estadística fue definida como P< 0,01.

RESULTADOS Y DISCUSION
Composición química de la harina cruda y extruida de Canavalia ensiformis
El contenido de proteínas, almidones y humedad en las harinas cruda y extruida se muestra en la Tabla 1. El proceso de extrusión no afectó el contenido de proteínas de la harina, pero disminuyó significativamente su contenido de humedad y se observó un incremento del 10% en la fracción de almidón en la harina tratada. Los valores de proteína total obtenidos para la harina cruda y tratada de canavalia, son bajos en comparación a otros estudios que en promedio reportan un 31%. Estas diferencias pueden deberse a las condiciones ambientales que prevalecieron durante el desarrollo del cultivar Original y madurez de la semilla. Al comparar los resultados obtenidos con otros genotipos de canavalia, el menor valor proteico corresponde al genotipo Original (22,23,24).

TABLA 1
Contenido total de proteínas, humedad y almidón en
harina cruda y extruida de Canavalia ensiformis

En la harina tratada (Tabla 2), se observó una contaminación de la fracción de almidón con proteínas que alcanzó un valor de 20%. Esto puede atribuirse a la desnaturalización de las proteínas de la harina durante el tratamiento, por lo que el almidón permanece atrapado en la matriz proteica, resultando en una fracción relativamente insoluble, que co-purifica, resultando difícil la separación por el procedimiento usado en este trabajo (25).

TABLA 2
Contenido de proteínas de la fracción de almidones
en harina cruda y extruida de Canavalia ensiformis

Digestibilidad in vitro de proteínas y almidones
Como se presenta en la Tabla 3, el proceso de extrusión aumentó la digestibilidad proteica in vitro de las harinas de 57,5 a 89,5%. No obstante, la digestibilidad de las proteínas de ambos tipos de harinas fue significativamente menor que el de la caseína (98.19%) utilizada como patrón de referencia. El valor de digestibilidad proteica de la harina cruda resultó ser mayor al reportado por Gómez (7), quien obtuvo un 50% de digestibilidad in vitro en la harina cruda del genotipo Original. Esta diferencia son probablemente debido a condiciones del cultivo y madurez de la semilla. La baja digestibilidad proteica de la harina cruda de canavalia al igual que la de otras leguminosas; quizás pueda deberse a su resistencia al ataque proteolítico y a la presencia de factores inhibidores de proteasas (7).

TABLA 3
Digestibilidad in vitro de proteínas y almidones

En la Tabla 3, se presenta el efecto de la extrusión sobre la digestibilidad in vitro de los almidones de canavalia. El tratamiento aumentó significativamente la digestibilidad del almidón desde 37,7 hasta 53%. La digestibilidad del almidón de la harina extruida fue significativamente mayor, que la digestibilidad del almidón de papa crudo usado como referencia, pero también menor que la del almidón de papa cocido usado como referencia. De acuerdo, a la naturaleza del almidón este puede formar complejos almidón-proteínas que son digeridos más lentamente que el almidón no acomplejado (25). La presencia de proteínas en la fracción de almidón (Tabla 2), aislada de la harina extruida pueden en parte, contribuir a la baja digestibilidad in vitro de este carbohidrato.

La cinética de hidrólisis de los almidones de papa y canavalia se presenta en la Figura 1. En los resultados obtenidos, se observó intensa degradación durante los primeros 30 minutos, con ligeros incrementos hasta los 210 minutos de incubación. El almidón de papa crudo fue más digerible que el almidón de canavalia crudo, y el almidón de papa cocido se degradó en mayor proporción que el almidón de canavalia extruida. Se ha reportado, que las harinas de canavalia son relativamente ricas en amilosa, alrededor de un 37.5% (26,27), la cual restringe la susceptibilidad del almidón al ataque amilolítico. Los resultados obtenidos confirman el hallazgo referente a que los almidones de las leguminosas son resistentes a la hidrólisis enzimática (27,28).

FIGURA 1
Cinética de hidrólisis de almidones tratados y no tratados de papa y Canavalia ensiformis: (♦),
almidón de harina canavalia cruda; (ÿ), almidón de harina canavalia extruida; (▲),
almidón de papa crudo; (●), almidón de papa cocido.
Las barras indican la desviación estándar de las medias; n = 5.

Factores antinutricionales
Por efecto de la extrusión, las actividades inhibitorias de tripsina, quimotripsina y α-amilasa disminuyeron hasta un 95% (Tabla 4). Estudios en diferentes leguminosas muestran que por medio de la cocción, se puede reducir significativamente la actividad de los inhibidores, pero persiste una actividad residual de los inhibidores de proteasas atribuido a la presencia de factores termoestables, los cuales parecen aumentar con el tratamiento (7). El tratamiento de extrusión parece ser muy efectivo para reducir los inhibidores de tripsina, quimotripsina y α -amilasa, sin modificar el contenido proteico en las harinas tratadas de canavalia; quizás esto pueda deberse a los principios físicos y mecánicos del tratamiento (10).

Efecto de la extrusión sobre la actividad hemaglutinante
En la Tabla 5, se presenta el efecto del tratamiento de extrusión sobre la actividad hemaglutinante de las harinas de canavalia. En comparación a los eritrocitos no tratados, la incubación de estos con tripsina y con pronasa aumentó sustancialmente el título hemaglutinante de los extractos acuosos de la harina cruda, indicando que estos tratamientos aumentan la sensibilidad de los eritrocitos de conejo frente a la Concanavalina A. El tratamiento de extrusión fue efectivo para eliminar la actividad hemaglutinante presente en la harina cruda de canavalia, de tal forma que esta no pudo ser detectada en los eritrocitos activados con enzimas proteolíticas. Estos resultados concuerdan con los expuestos por otros autores (28,29), quienes encontraron una alta sensibilidad de las hemaglutininas a los tratamientos térmicos debido a su naturaleza proteica.

TABLA 4
Efecto de la extrusión sobre la actividad inhibidora
de tripsina, quimotripsina y a-amilasa

TABLA 5
Actividad hemaglutinante en extractos de harina cruda
y extruida de Canavalia ensiformis

El contenido de canavanina de las harinas de canavalia
El tratamiento de extrusión no alteró el contenido de la canavanina (Tabla 6). Por su parte, el tratamiento de diálisis, disminuyó el contenido de canavanina de las muestras hasta valores cercanos al límite de detección del método utilizado. Los resultados de la Tabla 6 son similares a los reportados por Tepal y col. (29). Debido a que la temperatura de descomposición de la canavanina es de 184° C, resulta razonable que el tratamiento de extrusión realizado a 155° C no afectó el contenido de este aminoácido. El ligero incremento reportado en la Tabla 6, puede deberse al menor contenido de humedad de la harina extruida (Tabla 1) o a que el método de detección de la canavanina no es 100% específico, pudiendo detectar productos de su descomposición, ya que este método ha sido criticado por carecer de una especificidad absoluta y un umbral elevado de sensibilidad (30).

TABLA 6
Contenido de canavanina en harinas crudas
y extruidas de Canavalia ensiformis

Los resultados obtenidos con las harinas dializadas, confirman estudios previos los cuales mencionan que la descomposición del aminoácido podría conseguirse mediante remojo prolongado a temperaturas superiores a 184° C (7,31). Además se ha observado la disminución en la concentración de canavanina cuando el grano es sometido a remojo, debido a la solubilidad del aminoácido en agua, lo que permitiría su perdida en las aguas de remojo, esto puede ser debido a que durante el proceso se logra un mejor contacto entre las partículas de la harina y el calor (7,10,31).

En general, los resultados indican que el efecto de la extrusión de la harina de canavalia, bajo las condiciones usadas, fue sumamente efectivo para la reducción de inhibidores de proteasas, inhibidores de α-amilasas, hemaglutininas y aumentar la digestibilidad in vitro de proteínas y almidones, sin modificar el contenido proteico y la canavanina. Los resultados demuestran claramente la importancia de continuar investigaciones para mejorar la calidad nutricional de los granos de canavalia, con la finalidad de su incorporación en la alimentación animal y/o humana.

AGRADECIMIENTOS
El autor agradece al Dr. Andrés Carmona la constante ayuda prestada, así como sus valiosas observaciones durante la realización de este trabajo. Igualmente, el Grupo de Bioquímica y Nutrición, Instituto de Biología Experimental, Universidad Central de Venezuela, por posibilitar el uso de sus laboratorios para la realización de este trabajo.

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