HOME > EDICIONES > Año 2004, Volumen 54 - Número 4
Trabajos de Investigación
Deteccion de plaguicidas en vegetales de costa rica mediante la inhibicion de colinesterasas humanas
Karl Schosinsky Nevermann y Eugenia Quintana Guzmán
Centro de Investigaciones en Enfermedades Tropicales (CIET) y Departamento de Análisis Clínicos, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica
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RESUMEN
Deteccion de plaguicidas en vegetales de costa rica mediante la inhibicion de colinesterasas humanas
Mediante un método sencillo y de bajo costo basado en la inhibición de la actividad de las colinesterasas sérica y eritrocítica, se detectó la presencia de plaguicidas organofosforados y/o carbamatos en lechuga (Lactuca sativa), culantro (Coriandum santivum) y apio (Apium graveolens) obtenidos de las Ferias del Agricultor del Valle Central de Costa Rica. El porcentaje de inhibición de las colinesterasas se relaciona con la cantidad de plaguicida presente en el vegetal. El 13% del total de muestras analizadas resultaron ser positivas por estos plaguicidas al utilizar colinesterasa sérica como indicador y el 33% al utilizar colinesterasa eritrocítica. El lavado y el cocinado de los vegetales para ambas colinesterasas no causan mayor efecto en la eliminación del plaguicida pero tiende a disminuir ligeramente la concentración del mismo. Se encontró evidencia estadística altamente significativa (p = 0,0001) indicando que la colinesterasa eritrocítica presenta mayor sensibilidad analítica con respecto a la sérica.
Es de suma importancia determinar la presencia de plaguicidas en los productos agrícolas que consumimos, pues éstos están expuestos a contaminación por fumigación directa, contaminación de los suelos y aguas de riego, y por lo general son productos que se consumen sin un lavado adecuado y sin cocción.
Palabras clave: Colinesterasa sérica, colinesterasa eritrocítica, organofosforados, carbamatos, plaguicidas, vegetales, hortalizas.
SUMMARY
Pesticide detection in Costarican vegetables based on the inhibition of serum and erythrocytic human cholinesterases
A simple and low cost method able to detect the presence of pesticides, organophosphates and carbamates based on the inhibition of serum and erythrocytic cholinesterases, was used in lettuce (Lactuca sativa), cilantro (Coriandum santivum) and celery (Apium graveolens) obtained from the Ferias del Agricultor from Valle Central of Costa Rica. The percentage inhibition of cholinesterases is related to the presence of plaguicide in the vegetable. Thirteen percent of the analyzed samples were positive for plaguicides using serum cholinesterase and 33% for erythrocytic cholinesterase. Washing and cooking the vegetables does not eliminate the presence of plaguicides but they lower slightly the concentration. Statistical evidence (p = 0,0001) indicates that erythrocytic cholinesterase has higher analytical sensitivity than serum cholinesterase. It is very important to establish the degree of contamination with pesticides in these agricultural products because they are exposed to direct contamination by fumigation, soil contamination and irrigation water, and are products that are often consumed without adequate cooking and washing.
Key words: Serum cholinesterase, erythrocytic cholinesterase, organophosphates, carbamates, pesticides, vegetables, hortalices.
INTRODUCCION
Los plaguicidas son sustancias destinadas a prevenir, destruir o controlar
cualquier plaga. Esto incluye a los vectores de enfermedades humanas o animales
y a las especies no deseadas de plantas o animales que pueden causar perjuicio o
interferir en la producción, elaboración, transporte o comercialización de
alimentos (1-3).
Los plaguicidas son utilizados tanto en actividades agrícolas
como pecuarias y de salud pública por la que se fabrican aproximadamente 1.5
millones de toneladas al año (4). Se estima que actualmente el 85% de los
plaguicidas empleados en el mundo se dedican al sector agropecuario (5-8). Los
plaguicidas han dado un gran aporte a la agricultura y junto a los fertilizantes
son los que más han contribuido en el incremento del rendimiento agropecuario
(9). Costa Rica es el país centroamericano que más agroquímicos utiliza y se
calcula que casi duplica la cantidad per cápita de producto consumido con el
resto de la región (10).
El uso indiscriminado de estas sustancias está ocasionando
contaminación de aguas, suelo y alimentos, teniendo una incidencia negativa
sobre la vida silvestre y el hombre (11). La presencia de residuos de
plaguicidas en los alimentos que se derivan de su uso durante las diversas fases
de la producción, almacenamiento, elaboración, preparación y comercialización
ha despertado gran interés por sus repercusiones en la salud y como un factor
preponderante que interviene en las relaciones comerciales internacionales.
Los plaguicidas organofosforados y algunos carbamatos son
inhibidores de la colinesterasa, enzima humana que cataliza la hidrólisis de ésteres
del neurotransmisor colina, por lo que la determinación de la actividad de esta
enzima es un indicador de la exposición a estos compuestos (12). Hay dos tipos
de colinesterasas, la sérica y la eritrocítica. La actividad de la enzima sérica
disminuye más rápido que la eritrocítica, por lo que la determinación de la
actividad sérica es un índice muy sensible para prevenir intoxicación. La
determinación de la actividad de la enzima eritrocítica es de importancia en
los sistemas de vigilancia para intoxicaciones crónicas ya que permanece
disminuida por más tiempo que la sérica (13).
La intoxicación por plaguicidas organofosforados y
carbamatos produce efectos residuales, sobre todo en el Sistema Nervioso Central
y en el Periférico, así como en las funciones neuromusculares (14-16). Se ha
documentado que ciertos plaguicidas están asociados con el desarrollo de cáncer,
esterilidad y malformaciones congénitas y se presentan con frecuencia
intoxicaciones moderadas y severas. El contacto con el plaguicida se da por
aplicación directa, arrastre por el viento, por el agua o por tomarlo del suelo
contaminado o de otras fuentes del ambiente (17).
El uso masivo de plaguicidas para proteger la agricultura
requiere de la utilización de herramientas adecuadas para la detección de sus
residuos en los alimentos y en el agua para garantizar una protección ambiental
y dar seguridad al consumidor de estos productos agrícolas (18). Es de suma
importancia determinar el grado de contaminación por plaguicidas de los
productos agrícolas que consumimos, pues estos están expuestos a contaminación
por fumigación directa, contaminación de los suelos y aguas de riego, y por lo
general son productos que se consumen sin un lavado adecuado y sin cocción.
En un estudio piloto realizado por Concepción (19) en
productos agrícolas de la Feria del Agricultor de Costa Rica mediante pruebas
in vitro de inhibición de las colinesterasas, se encontró inhibición
considerable en la colinesterasa sérica en cebolla, lechuga, apio, culantro y
perejil y de colinesterasa eritrocítica en chile dulce, fresas, tomate,
culantro, perejil y repollo. Basados en este principio determinamos la presencia
de organofosfatos y carbamatos en lechuga, apio y culantro de las Ferias del
Agricultor del Valle Central de nuestro país.
El fundamento para la determinación de la actividad enzimática
de las colinesterasas se basa en las siguientes reacción (20):
Sustrato + colinesterasa ← tiocolina + sal del ácido
Tiocolina + DTNB ← TNB + disulfuro mixto
La formación de TNB es directamente proporcional a la
actividad enzimática.
Sustrato: propioniltiocolina para colinesterasa sérica y
acetiltiocolina para colinesterasa eritricítica
DTNB: ditionitrobenzoato (incoloro)
TNB: tionitrobenzoato (amarillo)
La exposición a bajos niveles de plaguicidas durante
periodos prolongados puede producir en humanos efectos nocivos tales como daños
en el sistema nervioso central, malformaciones congénitas, efectos mutagénicos
y cáncer, daños en la piel, pulmones, ojos, sistema inmunológico y
esterilidad en el hombre (21). Siendo que los organofosforados y carbamatos son
los plaguicidas de mayor uso en el agro costarricense (22) y a que el método a
utilizar detecta estos químicos, consideramos de suma importancia determinar el
grado de contaminación por plaguicidas de los productos que consumimos mediante
la utilización de una prueba de inhibición enzimática que presenta la ventaja
sobre los métodos tradicionales (cromatografía líquida) en que es sencilla,
de mucho menor costo y requiere de menor tiempo de análisis.
Metodos
Muestras: se obtuvieron 50 muestras de lechuga (Lactuca sativa), 50
de culantro (Coriandum santivum) y 50 de apio (Apium graveolens) en las Ferias
del Agricultor de Desamparados, Tres Ríos, Alajuela, Escazú y Guadalupe,
correspondiendo a la estación lluviosa de julio a octubre y al verano de
febrero a abril para un total de 150 muestras. Las Ferias del Agricultor fueron
seleccionadas con una probabilidad proporcional a su tamaño, entre aquellas que
se realizan en el Valle Central. Se escogieron las de tamaño mediano a las
cuales llegan entre 100 y 200 vendedores. Se recogieron 5 muestras de cada
vegetal en diferentes puestos de venta dentro de la misma feria. Cada producto
agrícola se empacó individualmente en bolsa plástica y como muestras control
se utilizaron los mismos productos agrícolas pero de origen orgánico.
Extractos: se pesaron 20 g de cada muestra sin lavado
previo, se procesaron en un extractor de jugos convencional. Posteriormente se
analizó "in vitro" el grado de inhibición de las colinesaterasas sérica
y eritrocítica de acuerdo a la metodología establecida por Concepción (19)
con ligeras modificaciones, como utilizar la mitad del volumen de extracto
vegetal y suero o eritrocitos y duplicar el tiempo de incubación de 30 minutos
a 60 minutos. Los productos agrícolas sin lavado que dieron un porcentaje de
inhibición enzimática superior al 15% se consideraron positivas por
plaguicidas y fueron nuevamente analizados previo lavado con agua del tubo y
también previa cocción del mismo en baño de agua en ebullición por 10
minutos.
Métodologia: se utilizó como fuente de colinesterasa sérica
una mezcla de sueros humanos a los que se les determinó su actividad por un método
cinético comercial (Biotec Internacional S.A., San José, Costa Rica), peparándose
alícuotas de 2,0 ml y se mantuvieron a -10°C. Como fuente de colinesterasa
eritrocítica se utilizó eritrocitos lavados con solución salina isotónica
por triplicado y resuspendidos con la misma solución a un volumen de glóbulos
rojos al 50% y se almacenaron -10 °C en alícuotas de 1 ml.
Colinesterasa sérica: se mezclaron 100 m
l de suero con 100 m l del extracto del producto agrícola
y se incubaron 1 hora a 37°C. Se colocó 20m l de
esta mezcla en 2,0 ml de reactivo de color y 100 m l
de sustrato, se homogenizó y se determinó el D
A/min. a una longitud de onda de 450 nm en un espectrofotómetro Shimadzu UV
160. Para calcular el porcentaje de inhibición enzimática se analizó un
control utilizando un extracto libre de plaguicidas (cultivo orgánico) de cada
vegetal analizado, cuya actividad enzimática corresponde al 100% de actividad.
Colinesterasa eritrocítica: se mezclaron 100 m
l de eritrocitos con 100m l del extracto del producto
agrícola y se incubaron 1 hora a 37°C. Se colocaron 10 m
l de esta mezcla en 2,0 ml de reactivo de color, se homogenizó e incubó por 10
min a 30°C. Se agregaron 100 m l de sustrato, se
homogenizó y se determinó el D A/min. a una
longitud de onda de 460 nm en un espectrofotómetro Shimadzu UV 160. Se aplicó
el mismo procedimiento para el análisis de las muestras control.
Cálculos:
Inhibición ( % ) = D
A/min. muestra (100) - 100
D A/min. control
Análisis estadístico: para el análisis estadístico se
emplearon pruebas de Chi-cuadrado para proporciones con tablas de contingencia
dada la naturaleza de los datos, se determinó si dos variables están
relacionadas o son independientes entre sí con un 95% de confianza. Se utilizó
el programa estadístico JMP de SAS.
Resultados
Las Tablas 1 y 2 muestran los resultados obtenidos con ambas
colinesterasas según porcentaje de inhibición para las muestras sin lavar,
lavadas y cocinadas de los vegetales analizados.
TABLA 1
Muestras positivas por colinesterasa sérica en vegetales
|
|
% de inhibición
|
Sin lavar
|
Lavada
|
Cocinada
|
| |
Lechuga
|
Apio
|
Culantro
|
Lechuga
|
Apio
|
Culantro
|
Lechuga
|
Apio
|
Culantro
|
|
|
16-25
|
0
|
1
|
0
|
2
|
1
|
0
|
2
|
3
|
1
|
|
26-35
|
3
|
4
|
0
|
2
|
1
|
1
|
1
|
2
|
1
|
|
36-45
|
1
|
1
|
2
|
1
|
0
|
1
|
0
|
1
|
0
|
|
> 46
|
4
|
2
|
2
|
1
|
2
|
1
|
4
|
1
|
1
|
|
Total
|
8
|
8
|
4
|
6
|
4
|
3
|
7
|
7
|
3
|
|
|
Total
de muestras sin lavar: 150
Total
de muestras lavadas: 20
Total
de muestras cocinadas: 20
|
TABLA 2
Muestras positivas por colinesterasa eritrocítica en vegetales
|
|
% de inhibición
|
Sin lavar
|
Lavada
|
Cocinada
|
|
|
Lechuga
|
Apio
|
Culantro
|
Lechuga
|
Apio
|
Culantro
|
Lechuga
|
Apio
|
Culantro
|
|
|
16-25
|
2
|
6
|
9
|
2
|
2
|
9
|
2
|
2
|
9
|
|
26-35
|
2
|
1
|
7
|
3
|
1
|
4
|
3
|
4
|
2
|
|
36-45
|
5
|
1
|
5
|
4
|
0
|
4
|
3
|
3
|
4
|
|
> 46
|
3
|
5
|
3
|
0
|
4
|
2
|
3
|
3
|
2
|
|
Total
|
12
|
13
|
24
|
9
|
7
|
19
|
11
|
12
|
1
|
|
|
Total
de muestras sin lavar: 150
Total
de muestras lavadas: 49
Total
de muestras cocinadas: 49
|
En la Tabla 3 se comparan las muestras positivas para ambas
colinesterasas, sin lavar y lavadas y en al Tabla 4 sin lavar y cocinadas. El análisis
estadístico evidencia que no hay diferencias significativas (p = 0,822) entre
las muestras positivas sin lavar y lavadas ni tampoco entre las positivas sin
lavar y cocinadas (p = 0,918).
TABLA 3
Total de muestras positivas sin lavar y lavadas
por colinesterasa sérica y eritrocítica
|
| Colinesterasa |
sin lavar |
Lavadas |
|
| Sérica |
20 |
13 |
| Eritrocítica |
49 |
35 |
| Total |
69* |
48* |
|
|
Total
de muestras para cada colinesterasa: 150. *p= 0,822 |
TABLA 4
Total de muestras positivas sin lavar y cocinadas
por colinesterasa sérica y eritrocítica
|
|
Colinesterasa
|
sin lavar
|
Lavadas
|
|
|
Sérica
|
20
|
17
|
|
Eritrocítica
|
49
|
40
|
|
Total
|
69*
|
57*
|
|
|
Total
de muestras para cada colinesterasa: 150. *p = 0,918
|
La Tabla 5 muestra los resultados de ambas colinesterasas según
el vegetal analizado (lechuga, apio y culantro), donde se observa diferencia
significativa en la proporción de muestras positivas (p = 0,01789) en la
colinesterasa eritrocítica sin que se obtenga con la colinesterasa sérica (p =
0,3973).
TABLA 5
Total de muestras positivas por colinesterasa
sérica y eritrocítica según el vegetal
|
|
Colinesterasa
|
lechuga
|
apio
|
culantro
|
|
|
Sérica*
|
8
|
8
|
4
|
|
Eritrocítica†
|
12
|
13
|
24
|
|
Total
|
20
|
21
|
28
|
|
|
Total
de muestras para cada colinesterasa: 150.
*p
= 0,3973
†p
= 0,01789
|
En la Tabla 6 se anota el número de muestras positivas según
el vegetal y el origen de la enzima utilizada, donde hay evidencia estadística
(p<0,0001) para considerar que la proporción de muestras positivas es
diferente para las dos colinesterasas.
TABLA 6
Total de muestras positivas por
colinesterasa sérica y eritrocítica
|
| Vegetal |
Sérica
|
Eritrocítica
|
| |
No
|
%
|
No
|
%
|
|
|
Lechuga
|
8
|
5
|
12
|
8
|
|
Apio
|
8
|
5
|
13
|
9
|
|
Culantro
|
4
|
3
|
24
|
16
|
|
Total
|
20*
|
13
|
49*
|
33
|
|
|
Total
de muestras para cada colinesterasa: 150 (cincuenta de cada vegetal).
*p < 0.0001
|
DISCUSION
Se analiza mediante los datos de la Tabla 1 que 20 (13%) de 150 muestras
dieron positivas por plaguicidas al utilizar colinesterasa sérica como
marcador. De éstas 19 (12,5%) presentaron porcentajes de inhibición superiores
al 25%, lo que consideramos que indica contaminación importante. La Tabla 2
muestra que 49 (33%) de 150 muestras analizadas con colinesterasa eritrocítica
resultaron ser positivas, de las cuales el 32 (21%) mostró porcentajes de
inhibición superiores al 25% indicando también un alto grado de contaminación
por plaguicidas.
Es importante destacar que si bien el lavado convencional con
agua potable y el cocinado de los vegetales en agua a ebullición por 10
minutos, tanto para la colinesterasa sérica como para la eritrocítica, no
causa mayor efecto en la eliminación del plaguicida, si tiende a disminuir la
cantidad del mismo ya que los porcentajes de inhibición disminuyen.
En la Tabla 3 se comparan las muestras positivas sin lavar
con la muestras positivas lavadas evidenciando que no hay diferencia
significativa (p = 0,822) entre las muestras positivas tanto para la
colinesterasa sérica como para la eritrocítica. Es decir que el lavado de
estos vegetales no elimina la presencia del plaguicida.
En la Tabla 4 también se observa que no hay diferencia
significativa (p = 0,918) entre las muestras positivas sin lavar y las cocinadas
al utilizar como marcadores ambas colinesterasas. Esto demuestra que la cocción
tampoco elimina la presencia del agente tóxico en los vegetales.
Con respecto a los tres vegetales utilizados (lechuga, apio y
culantro) se observa diferencia significativa en la proporción de muestras
positivas (p = 0,01789) cuando se utiliza colinesterasa eritrocítica. Es decir
que la cantidad de muestras positivas varía según el tipo de vegetal, dando
mayor número de positivos el culantro con un 48% del total de los culantros
analizados, mientras que para lechuga y apio un 25% mostraron positividad. Por
otro lado no hay diferencia en la cantidad de muestras positivas cuando se
utiliza la colinesterasa sérica (p = 0,3973) y el tipo de vegetal utilizado.
Sin embargo, el 16% del total de lechugas y apios analizados mostraron
positividad al igual que un 82% del total de culantros (Tabla 5). Se observa con
estos resultados un mayor porcentaje de positividad al utilizar colinesterasa
eritrocítica.
El Tabla 6 muestra evidencia estadística altamente
significativa (p = 0,0001) indicando que la proporción de muestras con un
porcentaje de inhibición positivo es diferente entre ambas colinesterasas,
presentando mayor sensibilidad la eritrocítica. Esto se debe probablemente a
que la colinesterasa sérica requiere mayor tiempo de incubación con el
plaguicida presente en el vegetal para que aumente la sensibilidad del método.
Con respecto a la estación del año se observa diferencia
significativa (p = 0,0039) para la colinesterasa sérica, indicando que el número
de muestras positivas en invierno es menor que en verano. De lo contrario, con
la colinesterasa eritrocítica no hay diferencia significativa (p = 0,384) entre
las dos estaciones del año.
Se concluye que este método basado en la inhibición de las
colinesterasas es altamente prometedor para determinar mediante estudios de
escrutinio la presencia de organofosforados o carbamatos en vegetales. Tiene la
ventaja sobre los métodos convencionales (cromatografía líquida de alta
resolución e inmunoenzimáticos) su bajo costo y rapidez de análisis sin que
se requiera de equipo sofisticado de alto costo y poca versatilidad. Sin embargo
este método no identifica ni cuantifica el tipo de pesticida pero sí permite
establecer el grado de toxicidad que puede producir al ser humano, ya que
utiliza colinesterasas humanas como indicadores. Este estudio piloto es el
primero que se realiza en Costa Rica y probablemente en Latinoamérica
utilizando la inhibición enzimática, consideramos que la metodología debe
optimizarse para lograr sensibilidad y exactitud óptimas.
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Recibido: 11/03/2004
Aceptado: 18/10/2004
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PRIVACIDAD | ACCESIBILIDAD
ALAN-VE ISSN 0004-0622 - Depósito Legal: pp 199602DF83
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