Extracción de los lípidos del TAM
Las ratas fueron sacrificadas por decapitación entre las 9:00 y 10:00 de la mañana. Posteriormente se extraía de la región interescapular el TAM, se hacía un pool hasta completar entre 0.3 - 0.4 gramos, luego se cortaban finamente y se enjuagaban con solución fisiológica a 4o C y se homogenizaban manualmente. Los lípidos se extrajeron siguiendo el método de Folch y Col. (18)

Determinación de triglicéridos en los lípidos totales del TAM
La concentración de TG en el TAM fue determinada en los lípidos totales mediante el método enzimático descrito por Carr y col. (19). Los resultados se expresan en mg/g de peso húmedo.

Separación de fosfolípidos y triglicéridos del TAM
Los fosfolípidos (FL) y triglicéridos (TG) del TAM, se separaron a partir de los lípidos totales mediante cromatografía de capa de capa fina sobre placas de sílica gel G-60, siguiendo el procedimiento descrito por Mangold (20). Para la corrida se empleó una mezcla de éter de petróleo: éter etílico: ácido acético en la proporción 90:10:1 (v/v/v). Las áreas correspondientes a TG y FL se identificaron mediante el empleo de estándares.

Obtención de los metil-ésteres de los ácidos grasos y separación por cromatografía gas-líquido
Los metil-ésteres de los ácidos grasos se obtenían de acuerdo al método descrito por Chalvardjian (21) con ligeras modificaciones: Los FL y TG raspados de las placas de capa fina se sometían a una reacción de transesterificación con metanol, para ello se empleaba una mezcla de metanol: ácido sulfúrico: tolueno y BHT al 1% como antioxidante, se llevaban a reflujo por una hora a 80oC bajo atmósfera de N2. Luego se extraían los metil-ésteres de los ácidos grasos con hexano, se evaporaba todo el solvente bajo una corriente de nitrógeno, luego se resuspendían en 10-20 uL de hexano. Para la separación de los metil-ésteres se inyectaba 1 uL, en un cromatógrafo gas-líquido marca Hewlett Packard e integrador, ambos modelo 5880 A. Las características de la columna fueron las siguientes: columna de vidrio de 4 mm x 183 cm, empacada con polietileno glicol adipato al 4% en peso sobre cromosorb AW de 80 mesh. Las condiciones para la separación fueron: temperatura del horno 200oC; temperatura del detector de llama 250oC; gas transportador Nitrógeno, y velocidad del flujo 60cm/min.

Incorporación de 1-14C ácido linoleico en el TAM e hígado de ratas lactantes de 6 días de edad. Separación de los productos desaturados del ácido linoleico
A las ratas lactantes de 6 días de edad se les administraban por vía intraperitoneal 10 μCi de 1-14C ácido linoleico, diluidos en 50 μL de aceite de pescado (pobre en ácido linoleico). Después de 2 y 6 horas, los animales (6 en cada grupo) fueron sacrificados por decapitación, y luego de obtener los hígados y TAM, se extrajeron los lípidos totales como se describió anteriormente. Para separar el ácido 1-14C linoleico de sus productos desaturados, primero se obtenían los metil-ésteres de los ácidos grasos, como también se explicó, y luego éstos se separaban sobre placas de silica gel G-60 impregnadas en nitrato de plata al 10%. Como solvente se empleó una mezcla de hexano: dietiléter en proporción 85:15 (v/v). Para visualizar el ácido linoleico y sus productos, la placa se rociaba con 2´ 7´dibromofluoresceína al 1% en etanol, y las manchas se visualizaban bajo luz UV. La identificación se realizó mediante el empleo de estándares. Las zonas identificadas se raspaban y se colocaban en viales que contenían 10 mL de una solución de PPO / POPOP en tolueno, y la radioactividad se midió en un contador 1219 Rack Beta LKB (Suecia).

Análisis estadístico

Se emplearon las pruebas de ANOVA de una vía, prueba de Tuckey y t de Student.

RESULTADOS
En la Tabla 1, se presentan el peso del TAM de las ratas durante los primeros 20 días de la vida postnatal. En la primera semana el TAM representaba cerca del 1% del peso corporal y hacia el final del estudio un 0,5%. A simple vista se pudo observar que hasta el día doce, el TAM de las ratas era de color oscuro y muy bien delimitado, después se tornaba pálido y los límites se hacían difusos. La concentración de triglicéridos antes del inicio de la lactancia fue escasa (1.5 mg/g de peso húmedo), pero después comenzó una rápida acumulación de éstos, a los 12 días de edad la concentración ya sobrepasaba los 100 mg/g de peso húmedo. En la Tabla 2 se presenta la distribución porcentual de AG en los TG del TAM. Se puede apreciar que desde el nacimiento hasta los 6 días de edad, las proporciones de ácidos grasos saturados (AGS), monoinsaturados (AGMI) y poliinsaturados (AGPI) fueron similares. A los 6 días de edad, los AGPI-CL representaban más del 21% del total de ácidos grasos, los más abundantes fueron el 20:3n-6 y el 20:4 n-6 (9.36 y 6.14 % respectivamente), y en menor proporción el 22:5n-3 (2,16%) y el 22:6n-3 (1,99%). Después de este período, la composición cambió significativamente, el porcentaje de AGS aumentó por encima del 45% y ocurrió un descenso en los AGPI, debido principalmente a la disminución del C20:3 n-6 y C20:4 n-6 (p<0.05) (porcentajes menores al 2%). La Tabla 3 muestra la composición de AG en los fosfolípidos del TAM; el porcentaje de AGS fue más o menos constante, alrededor del 33%, y sólo estaban presentes el C16:0 y el C18:0, este último fue el más abundante después del inicio de la lactancia. El porcentaje de los AGMI descendió considerablemente después del primer día, de 20% a 10% aproximadamente (p<0.05), lo que fue contrarrestado por un aumento de los AGPI n-6, principalmente del C20:3 n-6 y C20:4 n-6 (p<0.05). También se observó una disminución significativa del C22:6 n-3, después de la primera semana.

TABLA 1
Pesos: corporal, del tejido adiposo marrón (TAM) y del hígado;
y concentración de triglicéridos en el tejido adiposo marrón de ratas lactantes

TABLA 2
Porcentaje de ácidos grasos en los triglicéridos totales
del tejido adiposo marrón de ratas lactantes

TABLA 3
Composición porcentual de ácidos grasos en los fosfolípidos
totales del tejido adiposo marrón de ratas lactantes

La Tabla 4 muestra los resultados de la incorporación de 1-14C ácido linoleico y los productos desaturados de éste, en el hígado y en el TAM de las ratas de 6 días de edad. Se aprecia que la incorporación de 1-14C ácido linoleico en el hígado fue aproximadamente 10 veces mayor que en el TAM, sin embargo la relación en d.p.m entre los productos desaturados de 1-14C ácido linoleico / 1-14C ácido linoleico (PD/AL) fue más alta en el TAM que en el hígado, tanto a las 2 horas como a las 6 horas después de la inyección intraperitoneal.

TABLA 4
Incorporación de [1-14C] ácido linoleico y sus productos desaturados
en el tejido adiposo marrón e hígado de ratas de seis días de edad

La baja concentración de TG en el TAM (1.5 ± 0.3 mg/g peso húmedo), observada en las ratas de 1 día de edad, indica que este tejido no puede representar un reservorio importante de ácidos grasos durante el desarrollo prenatal. Sin embargo, después del nacimiento, la rápida acumulación de TG que se inició con la lactancia, así como la alta proporción de AGPI-CL que se observó a los 6 días de edad (40 mg de TG/g de peso húmedo y aproximadamente 23% de AGPI-CL) indican que durante la primera semana el TAM acumuló una considerable cantidad de AGPI-CL, especialmente de la familia n-6 y en menor grado de la n-3, y aunque después de este período la proporción de todos los AGPI-CL disminuyó a un 5%, se puede estimar que la cantidad total almacenada fue siempre elevada, ya que la concentración de TG casi se triplicó entre los días 6 y 12 de edad y en adelante permaneció alta (más de 100 mg de TG/g de peso húmedo; Tabla 1). Se puede considerar entonces que el TAM en las ratas recién nacidas, además de cumplir con su función termogénica, podría funcionar como un importante depósito de AGPI-CL, los cuales podrían ser suministrados a los órganos y tejidos que se están desarrollando rápidamente en ese período, especialmente al cerebro por presentar la mayor tasa de crecimiento y por el alto requerimiento que tiene de C20:4n-6 y C22:6n-3. Este planteamiento se fundamenta también, en observaciones realizadas por otros investigadores, por ejemplo: El TAM exporta diversas sustancias, entre estas ácidos grasos (22). La exportación de ácidos grasos puede ser significativa en el TAM, ya que su actividad lipolítica supera la capacidad oxidativa de ácidos grasos (15,16). Además, estudios in vitro han demostrado que el grado de movilización de los ácidos grasos C20:5 n-3; C20:4n-6; C20:3n-6 y C22:6n-3 es más alta que la observada para C16:0 y C18:2n-6, a pesar de que éstos son más abundantes que los primeros (23).

Nuestro planteamiento es similar al propuesto por Speake y colaboradores (23), quienes observaron que en el tejido adiposo de embriones de pollo ocurría una acumulación de AGPI-CL, y que la concentración de éstos disminuía durante el crecimiento de los tejidos neurales. En base a estos resultados, propusieron que el tejido adiposo de los embriones de pollo posiblemente funcionan como un intermediario en la transferencia de los AGPI-CL desde la yema hacia los tejidos neurales.

Por otra parte, Lefkowitz y col. (9) hacen una observación importante sobre la posible presencia de depósitos de AGPI-CL durante el período de rápido crecimiento del cerebro en la vida postnatal de la rata. Ellos suministraron d5-C18:3 n-3, como única fuente de

AGPIn-3, a un grupo de ratas desde los 7 hasta los 28 días de edad. Al examinar la composición de AG del cerebro al final del período experimental, encontraron que el 40% de C22:6 n-3 acumulado estaba sin marcar con deuterio, es decir, que durante la primera semana de nacidas, las ratas habían almacenado una cantidad importante de C22:6 n-3. En este sentido, nuestros resultados evidencian que los TG del TAM representan un depósito cuantitativamente importante de AGPI-CL, especialmente de C20:4n-6, de su precursor C20:3 n-6 y, en menor proporción de C22:5 n-3 y C22:6 n-3.

En los FL también se observó un enriquecimiento de AGPI-CL n-6 con el inicio de la lactancia (en un 10% o más) y, en adelante la composición de éstos no cambió significativamente. Es decir, en los FL a diferencia de Los TG no se apreció un cambio acentuado en la composición de AG después de la primera semana de edad, probablemente por la función estructural y funcional que cumplen estos lípidos. Sin embargo, no se descarta que durante el proceso normal de involución del TAM, que ocurre durante el crecimiento de los mamíferos, la degradación de los FL de las membranas mitocondriales, muy abundantes en el tejido activo (10), pueda aportar al plasma cantidades importantes de AGPI-CL.

Por otra parte, la presencia de productos desaturados del 1-14C ácido linoleico, tanto en el hígado como en el TAM, a las 2 y 6 horas después de la inyección intraperitoneal de1-14C ácido linoleico, indican que en algún grado ocurrió síntesis de AGPI-CL en las ratas de 6 días de edad (edad en la cual se observó la mayor concentración de AGPI-CL en TG). Aunque la incorporación total de 1-14C ácido linoleico fue mayor en el hígado que en el TAM, es significativo resaltar que la relación en d.p.m. entre "los productos desaturados del 1-14C ácido linoleico / 1-14C ácido linoleico" (PD/AL) fue aproximadamente cuatro veces mayor en el TAM que en el hígado (Tabla 4). Estos resultados, aunque muy preliminares, podría indicar que en el TAM se sintetizan AGPI-CL con mayor eficiencia que en el hígado.

En conclusión, nuestros resultados revelan que el TAM es un depósito cuantitativamente importante de AGPI-CL durante los primeros días de la vida postnatal de la rata. Es probable que estos ácidos grasos provengan principalmente de la leche materna y, en alguna extensión de la síntesis endógena. Tomando en conjunto, nuestros resultados y los de otros investigadores (9,15,16,22,23), nosotros proponemos que el TAM tiene un alto potencial para contribuir con el mantenimiento de la alta concentración de AGPI-CL encontrada en el plasma de ratas recién nacidas (24), durante el período de máximo crecimiento postnatal del cerebro.

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