Los efectos tóxicos de la hipervitaminosis A aguda en los animales experimentales están muy bien documentados; entre los animales, la rata parece ser especialmente sensible a la hipervitaminosis A (2). En vista que la vitamina A se almacena principalmente en el hígado, el cual desempeña un papel de gran importancia en su metabolismo inicial y en su liberación hacia los tejidos periféricos (1), y que la hipervitaminosis A crónica determina marcados cambios a nivel hepático como: necrosis hepatocelular, degeneración grasa y cirrosis en los animales experimentales (2), a lo cual se puede agregar, de acuerdo con nuestro conocimiento, que son muy pocas las publicaciones existentes sobre los efectos de la hipervitaminosis A aguda sobre la actividad enzimática hepática en los animales experimentales, estos hechos motivaron la realización del presente trabajo en el cual se describe, en ratas, las manifestaciones clínicas y los cambios en la actividad hepática de diversas clases de enzimas (oxido-reductasas, transferasas e hidrolasas) determinados por la administración intramuscular de dosis crecientes de vitamina A (retinol), durante un periodo de 7 días (hipervitaminosis A aguda).


MATERIALES Y METODOS
El Protocolo fue aprobado por el Departamento de Bioquímica, Facultad de Medicina, que se encargó de velar por el buen uso y cuidado de los animales de laboratorio y avaló los procedimientos experimentales utilizados en estas ratas.

Diseño experimental
Se emplearon 60 ratas macho Wistar, de 12 semanas de edad, con pesos 180 y 200 gramos, mantenidas en jaulas metabólicas individuales, durante una semana, para su adaptación al ambiente del laboratorio. Los animales tuvieron libre acceso al agua de bebida y a la comida durante el periodo de adaptación. Después de este periodo de adaptación, los animales se distribuyeron al azar en 4 grupos, de 15 ratas cada grupo, sin que hubiese diferencias significativas previas entre los promedios de peso de los distintos grupos. Los grupos 1 al 3 (grupos tratados) recibieron inyecciones intramusculares de 30.000, 50.000 y 100.000 UI/día de palmitato de vitamina A (Merck, vitamina A palmitato hidrosoluble; 1 mL= 100.000 UI) por siete días. Al grupo 4 que se utilizó como control, se le administró por la misma vía, y durante el mismo lapso, solución salina. Los volúmenes administrados tanto de vitamina A, como de solución salina, siempre fueron de 1 ml. Durante el periodo experimental, los animales recibieron el mismo alimento, tuvieron libre acceso al agua de bebida y se examinaron para descubrir cualquier manifestación patológica. Las ratas se pesaron en una balanza Sartorius y se registró el consumo de comida y de agua al principio y al final del periodo experimental.

A las 24 horas de administrada la última dosis de vitamina A o de solución salina, según los casos, los animales se anestesiaron con éter etílico, se decapitaron con una guillotina Harvard y se desangraron durante 1-3 minutos. Se practicó laparotomía mediana dejando al descubierto los lóbulos hepáticos, que fueron resecados y colocados en cápsulas de Petri, sobre baño de hielo. Los homogenatos hepáticos se prepararon al 10% (p/v) (1 gramo en 10 mL de agua bidestilada) utilizando un homogenizador de Potter-Elvehjem, se congelaron de inmediato y se utilizaron para las determinaciones enzimáticas, en un plazo no mayor de 48 horas.

Actividades enzimáticas valoradas
La glucosa-6-fosfatasa (G-6-Pasa, EC 3.1.3.9.) se estimó según la técnica de Harper, utilizando como sustrato glucosa-6-fosfato (3). El fósforo inorgánico (Pi) liberado en la reacción enzimática se valoró según las recomendaciones de Fiske y Subbarow (4), expresándose los resultados en mmol de Pi liberados por gramo de tejido/minuto de incubación. La glucógeno fosforilasa (GF, EC 2.4.1.1) se valoró según el método de Niemeyer et al. (5) utilizando como sustrato una mezcla que contenía glucosa-1-fosfato, adenosinmonofosfato (AMP) y glucógeno (pH 6). El Pi liberado en la reacción enzimática se valoró según Fiske y Subbarow (4), expresándose los resultados en unidades de fosforilasa (UF). Una unidad de fosforilasa se define como la cantidad de enzima que libera 1 mmol de Pi durante 5 minutos de incubación a 300C. La actividad de la a-amilasa (AMS, EC 3.2.1.1) se determinó según el método descrito por Rinaudo et al. (6), utilizando almidón hidrosoluble tamponado como sustrato. Los resultados se expresan en milimoles de glucosa liberados por gramo de tejido/hora de incubación. La maltasa ácida (MA o a-1,4-glucosidasa ácida, EC 3.2.1.20) se cuantificó según la técnica de Gamklou y Scherstén modificada (7), utilizando un sustrato tamponado de maltosa. Los resultados se expresan en mmoles de glucosa liberados por gramo de tejido y por hora de incubación. La aspartato aminotransferasa (AST) o transaminasa glutámico-oxaloacética (TGO) (EC 2.6.1.1) y la alanina aminotransferasa (ALT) o transaminasa glutámico-pirúvica (TGP) (EC 2.6.1.2) se determinaron mediante el método de Reitman y Frankel (8) utilizando aspartato y D,L-alanina como substratos, respectivamente. Los resultados se expresan en Unidades de actividad por gramo de tejido fresco. La arginasa (EC 3.5.3.1) se determinó según el procedimiento descrito por Bhide et al. (9), empleando la arginina como substrato. La urea producida durante la reacción enzimática se cuantificó con a-isonitrosopropiofenona expresándose los resultados en mmoles de urea producidos por gramo de tejido/hora de incubación. La colinesterasa (CHE; EC 3.2.1.7) se midió según el método electrométrico de Michel (10) con un pH-meter Orion, empleando para la reacción un sustrato tamponado de acetilcolina. La actividad de la CHE, que representa la disminución de pH que ocurre a 25oC en un lapso de 1 hora, se expresó en UpH/hora por gramo de tejido/mg de proteína. La proteasa ácida (PAc, EC 3.4.1.14.) se determino como actividad proteolítica ácida total empleando como sustrato hemoglobina al 4% en buffer acetato 0.1 mol/L (pH 4.5) según las indicaciones de Dingle et al, (11). Los resultados se expresaron en mmoles de tirosina liberados por miligramo de tejido y por hora de incubación. La fosfatasa alcalina (ALP, EC 3.1.3.1) se estimó mediante el método de Walter y Schütt (12) empleando una solución tamponada de p-nitrofenilfosfato (pH 9.8). La actividad de la enzima se expresó en mmol de p-nitrofenol liberados en 30 minutos por gramo de tejido. La actividad de la deshidrogenasa láctica (LDH, EC 1.1.1.27) se estimó según el método de King (13) que se basa en la propiedad de la enzima para formar piruvato, a partir del D,L-lactato, en presencia de nicotín-adenín-dinucleótido oxidado (NAD+). La actividad se expresó en unidades internacionales (UI) por gramo de tejido húmedo. El contenido de vitamina A en hígado se determino de acuerdo con la técnica de Neeld y Pearson (14), los resultados se expresan en mmol por gramo de peso húmedo. La nomenclatura empleada para cada enzima es la correspondiente a la Unión Internacional de Bioquímica.

Análisis estadístico
Los resultados se expresan como promedios±desviaciones estándar (DE). Las diferencias en la actividad de las enzimas y las otras variables (peso de los animales, contenido hepático de vitamina A, etc.) entre el grupo control y los tratados con vitamina A (1-3) se analizaron por la prueba de ANOVA de una vía y test de Tuckey post-ANOVA. Las diferencias significativas entre cada grupo tratado y el control correspondiente se analizaron mediante la t de Student. El análisis de regresión lineal se utilizó para establecer las relaciones entre las diversas variables y las dosis administradas de vitamina A. Toda p<0,05 se considero estadísticamente significativa. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete estadístico STATGRAPHICS PLUS 5.0.


RESULTADOS
Hallazgos clínicos
En la mayor parte de las ratas tratadas con vitamina A se observó disminución de la ingesta alimenticia y acuosa, del peso corporal (Tabla 1) y de la actividad muscular, con caída del pelo e irritabilidad, edema palpebral unilateral y secreción mucopurulenta, hemorragias externas, sin parálisis de las extremidades posteriores. En términos generales, la intensidad de las manifestaciones clínicas es proporcional a las dosis administradas del retinol. Con la dosis de 100.000 UI/día, ocho de los animales presentaron marcado deterioro orgánico y fallecieron, al sexto día de iniciada la administración de la vitamina A. El examen post-mortem de estos animales reveló marcadas hemorragias a nivel muscular, pulmonar y visceral. En el grupo control no se detectaron manifestaciones clínicas.

TABLA 1
Variaciones del contenido hepático de vitamina A,
del peso, consumo alimentario
e ingesta acuosa de los animales tratados con
vitamina A y del grupo control

Resultados bioquímicos
El contenido de vitamina A en el hígado de los animales tratados se muestra en la Tabla 1. El ANOVA de una vía y cuatro periodos demostró que todos los promedios de los grupos tratados difieren significativamente (F= 3,375; GL= 3/48; p<0,05) al comparar entre sí y con el grupo control. El coeficiente de correlación (r= 0,979) obtenido al relacionar las dosis de vitamina A con su contenido hepático, mediante el método de regresión simple, demuestra que la concentración de la vitamina en hígado aumenta de manera significativa (p<0,05) y proporcional con las dosis administradas del retinol.

El efecto de la hipervitaminosis A sobre la actividad de las enzimas hepáticas valoradas se muestra en la Tabla 2. El ANOVA de una vía y cuatro periodos demostró que las actividades enzimáticas promedio difieren significativamente (F>8,90 en todos los casos; GL: 3/48; p<0,05) al comparar entre sí los grupos tratados y el grupo control. El análisis de regresión simple demostró que la ALT (r= 0,894; r²= 69,14%), la AST (r= 0,920; r²= 77,06%), la ALP (r= 0,970; r²= 91,17%), la LDH (r= 0,884; r²= 67,83%), la proteasa ácida (r= 0,991; r²= 97,16%) y la maltasa ácida (r= 0,989; r²= 96,85%) incrementan su actividad significativamente (p<0,05) con la administración de vitamina A, alcanzando un valor máximo con las 100.000 UI.

TABLA 2
Efecto de la hipervitaminosis A aguda sobre las enzimas
hepáticas en los animales tratados y en el grupo control

Puesto que el valor P en la tabla ANOVA, del análisis de regresión simple, es menor de 0,01, existe una relación estadísticamente significativa entre estas actividades enzimáticas y la vitamina A a un nivel de confianza del 99%. Los valores de los estadísticos r² de 69,14%, 77,06%, 91,17%, 67,33%, 97,16%, y 96,85% para ALT, AST, ALT, LDH, proteasa y maltasa ácida, respectivamente, indican que el modelo como se ajustó explica el 69%, el 77%, el 91%, el 67%, el 97% y el 97% de la variabilidad de las actividades enzimáticas determinadas por la administración de la vitamina, lo cual sugiere que otros factores que no fueron estudiados pudieran influir en nuestros resultados. El análisis de regresión lineal y las diferencias entre las pendientes en las respectivas rectas de regresión demuestran que la variación observada en las actividades enzimáticas es positiva y altamente significativa (p<0,05) y que el incremento es directamente proporcional a la dosis administrada y al contenido hepático de vitamina A. El análisis de regresión simple también demostró que la glucosa-6-fosfatasa (r= -0,703; r²= 55,54%), la glucógeno fosforilasa (r= -0,797; r²= 45,26%), la a-amilasa (r= -0,953; r²= 90.80%), la arginasa (r= -0,889; r²= 68,54%) y la colinesterasa (r= -0,982; r²= 94,54%) disminuyen su actividad en relación con las dosis administradas de vitamina A. Los respectivos r2 indican, al igual que en el caso anterior, que existen factores que pueden haber influido y que no fueron investigados en el presente estudio. Los resultados del análisis de regresión lineal y las diferencias entre las pendientes en las respectivas rectas de regresión demuestran que la variación observada en las actividades enzimáticas es negativa y altamente significativa (p<0,05) y que la disminución es proporcional a la dosis administrada y al contenido hepático de vitamina A.

DISCUSION
La vitamina A administrada en exceso determinó una hipervitaminosis A aguda que se demostró por el marcado incremento de los niveles de retinol en hígado, los signos clínicos descritos y los cambios en las actividades enzimáticas a nivel hepático.

Los signos clínicos detectados en la presente investigación se caracterizan por cambios en la piel, pérdida del apetito, pérdida del peso, caída fácil del pelo, irritabilidad, hemorragias internas y externas, infecciones conjuntivales y muerte de los animales. La hemorragia constituye una de las manifestaciones típicas de la hipervitaminosis A, en los animales experimentales (2); puede ser subcutánea o intramuscular, aunque en la mayor parte de las ratas el proceso se localiza a nivel pulmonar y visceral, determinando la muerte, cuando es muy intensa.

La marcada disminución en la ingesta de alimentos y de agua se debe a la pérdida del apetito, inducido por la hipervitaminosis A. Es interesante señalar que el ácido retinoico, un derivado natural de la vitamina A, suprime la expresión del neuropéptido Y (NPY) (15), una potente señal orexigénica. Por esta razón, es posible que los efectos directos inhibidores del retinol y/o del ácido retinoico sobre el sistema NPY, pudieran disminuir el ingreso alimentario.

Las infecciones son también frecuentes en la hipervitaminosis A, tanto aguda como crónica, debido al depósito de grandes cantidades de vitamina A en las células de Küpffer, con el deterioro de la capacidad fagocitaria de estas células y disminución de los mecanismos de defensa del organismo, lo cual predispone al animal a las infecciones secundarias. Lettinga et al., (16) han señalado, en ratas, que la administración de altas dosis de retinol, durante una semana, disminuye la capacidad de fagocitosis de las células de Küpffer.

En relación a los mecanismos que determinan los efectos tóxicos de la vitamina A sobre los tejidos, es un hecho conocido que el exceso de vitamina A libre labiliza las membranas lisosomales de hígado de rata, por su actividad detergente tensoactiva y membranolítica y determina la liberación de una gran variedad de hidrolasas ácidas (manosidasas, catepsinas, ribonucleasa, desoxirribonucleasa, fosfatasa, a-1,4-glucosidasa o maltasa ácida, proteasa, b-glucuronidasa y sulfatasa, entre otras), que se encuentran en los lisosomas (17). Efecto que es potenciado por la anoxia y la acidosis intracelular, determinadas por la hemorragia presente. Dingle (18) comprobó que este complejo enzimático es el responsable de muchos de los cambios observados en los tejidos tratados con dosis excesivas de vitamina A. Los resultados de la presente investigación que demuestran el incremento en la actividad de las hidrolasas ácidas lisosomales (proteasa y maltasa ácida) concuerdan con estas observaciones previas. Estas enzimas lisosomales están comprometidas en procesos inflamatorios y en la destrucción autolítica de los tejidos (19). Por otro lado, las interacciones de los retinoides (vitamina A y derivados naturales) con sus receptores nucleares pueden jugar un papel muy importante en este proceso de toxicidad, modificando la expresión de los genes (20).

Las enzimas alanina aminotransferasa (ALT) y aspartato aminotransferasa (AST) que incrementan significativamente (p<0,05) su actividad en el hígado de ratas tratadas con vitamina A, están relacionadas con el catabolismo proteico y sus actividades tisulares aumentan en situaciones de gluconeogénesis incrementada (21). El marcado incremento en la actividad de la ALT es especialmente significativo porque la alanina es el substrato cuantitativamente más importante para la gluconeogénesis hepática (22). El incremento en la actividad de la LDH, debido la hipoxia tisular determinada por la hemorragia presente (23), es un hecho importante ya que el lactato que se libera en exceso de las células que llevan a cabo la glucólisis anaerobia, por efecto de la hipervitaminosis A (24), lo recoge especialmente el hígado, donde se reoxida a piruvato, por la LDH. En este órgano, el piruvato se transamina por acción de la ALT para formar alanina, que se utiliza en los procesos de gluconeogénesis (21,22).

Nuestros resultados claramente muestran un marcado incremento en la actividad de la fosfatasa alcalina en los animales tratados que concuerda con los estudios previos de Alarcón (25) quién con diferentes técnicas histoquímicas, demostró una reacción positiva de la enzima en las estructuras interlobulillares hepáticas, en los canalículos biliares y en la adventicia de los vasos, más intensa que en los testigos, en conejos tratados con 100.000 UI/día de vitamina A. También, Lettinga et al., (16) en ratas tratadas con dosis altas de retinol, durante 7 días, demostraron mediante técnicas histoquímicas que la actividad de la ALP está incrementada en las membranas plasmáticas de los canalículos biliares con una mayor actividad en las áreas periportales. Esto se puede interpretar como un proceso activo de transporte de los ésteres de retinilo desde las células parenquimatosas hepáticas hacia la bilis. El incremento en la actividad de la fosfatasa alcalina se puede relacionar a la unión del retinol a los receptores nucleares de los hepatocitos, que pueden aumentar la diferenciación celular y la expresión de los genes, y esto coincide con los niveles elevados de ALP (26).

La reducción en la actividad de la glucógeno fosforilasa en los animales tratados con vitamina A pudiera deberse al incremento en la concentración hepática de Zn, un inhibidor de la actividad de esta fosforilasa (27) y a la disminución del ingreso alimentario, que reduce la cantidad de la proteína enzimática (5). Aunque, Rinaudo et al., (6) en ratas blancas jóvenes a las cuales se les administró por vía subcutánea 7.000 a 14.000 UI/día de una solución oleosa de vitamina A, por un periodo de 7 días, observaron un incremento del 25% (p<0,05) en la actividad de la fosforilasa en comparación con el grupo control.

La glucosa-6-fosfatasa una enzima multifuncional (28), de gran importancia en el metabolismo intermediario de los glúcidos, también disminuyó su actividad en los animales tratados con vitamina A, debido al incremento en la concentración hepática de fósforo inorgánico (29) y de Zn (30) dos inhibidores de la enzima (27,31). Por el contrario, Singh et al., (32) en ratas blancas jóvenes, alimentadas con un exceso de retinol por vía oral, demostraron un incremento en la actividad de la glucosa-6-fosfatasa. Quizás estas diferencias pueden deberse al tipo de compuesto empleado, a la dosis administrada, al tiempo de administración, a la vía de administración de la vitamina o a la edad de los animales utilizados.

La a-amilasa, una enzima que participa en la producción de glucosa por las células hepáticas, disminuyó significativamente (p<0,05) su actividad por el exceso de vitamina A; hallazgo que concuerda con los trabajos previos de Rinaudo et al., (6). La disminución de los iones cloruro y calcio (33), iones activadores de la enzima (34,35) y el incremento en la concentración del Zn, un ión inhibidor, en hígado (30), por efecto de las dosis elevadas de vitamina A, deben favorecer esta disminución.

La colinesterasa (pseudocolinesterasa) se produce en el hígado y se encuentra en todos los tejidos, especialmente en el páncreas. Existe una estrecha correlación entre la síntesis de albúmina y la producción hepática de esta hidrolasa, a tal punto que los niveles enzimáticos disminuyen en enfermedades caracterizadas por una síntesis de albúmina disminuida (23). En la presente investigación se encontró una disminución significativa (p<0,05) en su actividad en los animales tratados con vitamina A. Para explicar estos hallazgos debemos tener presente el trabajo de Çolakoglu y Kükner (36) quienes al estudiar, en ratas, el efecto de administrar dosis altas de ácido retinoico, un metabolito de la vitamina A, por un corto lapso de tiempo, sobre la estructura del hígado, observaron mediante estudios de microscopia óptica y electrónica: dilatación sinusoidal, infiltración celular periportal, incremento de las gotas de lípidos en las células de Ito, que se correlacionan con el incremento en la cantidad de ácido retinoico suministrada. Estos resultados indican que las dosis altas de este compuesto alteran el tejido hepático, con alteraciones en su función. Este grado de disfunción hepática, a lo cual se suma un deficiente ingreso alimentario, la existencia de infecciones agudas, la infiltración grasa, la disminución en la síntesis de la albúmina (37) son factores que influyen en la disminución de la actividad y/o síntesis de la CHE a nivel hepático. Esta alteración del tejido hepático debe favorecer las alteraciones enzimáticas comentadas en los párrafos anteriores.

La arginasa, una enzima presente en grandes cantidades en el hígado que cataliza la transformación de la arginina en urea y ornitina (38), también disminuyó significativamente (p<0,05) su actividad. Esta disminución que obedece, entre otros factores, a la disminución del ingreso alimentario (39) explica la falla en la ureogénesis hepática descrita en la hipervitaminosis A (37) que altera el proceso de detoxicación del amoníaco (NH3), cuyo incremento excesivo en sangre conduce a un síndrome denominado encefalopatía hepática, una manifestación presente en la enfermedad hepática grave o en etapa terminal (40). Por su parte, Lettinga et al., (16) en ratas tratadas con dosis altas de retinol, durante 7 días, encontraron que los mecanismos de regulación de los niveles sanguineos del amoníaco están muy deteriorados.

En conclusión, en todos los casos, el grado de variación de la actividad enzimática se relaciona con el contenido hepático de la vitamina A. Además nuestros resultados proporcionan evidencias que la administración de altas dosis de vitamina durante cortos periodos determinan manifestaciones clínicas muy diversas y variadas y producen una marcada alteración de la actividad de las enzimas hepáticas, lo cual debe producir, a su vez, un deterioro en los metabolismos glucídico y proteico. Aunque, los resultados obtenidos en animales tratados con dosis altas de vitamina A no pueden ser definitivamente extrapolados al hombre, estos hallazgos deben ser tomados en cuenta como indicadores de la posible ocurrencia de efectos similares en los humanos.

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