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Estudio comparativo del consumo de aceite de oliva virgen o seje sobre el perfil lipídico y la resistencia a la oxidación de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) del plasma de rata
María Isabel Giacopini, Omaira Guerrero, Manuel Moya, Virgilio Bosch
REVISTA: Archivos Latinoamericanos de Nutrición

NUMERO: Año 2011, Volumen 61 Número 2

TITULO: Elaboração de barra de cereais com casca de abacaxi

AUTORES: Renata Siqueira Fonseca, Victor Rogério Del Santo, Gilberto Batista de Souza, Cíntia Alessandra Matiucci Pereira

RESUMEN: Nosotros comparamos los efectos del consumo de aceite de seje (Oenocarpus bataua), con respecto el de oliva virgen sobre la concentración de los lípidos del plasma y de la susceptibilidad de oxidación in vitro de las lipoproteínas de alta densidad (HDL) en la rata Sprague Dawley.

PALABRAS CLAVE: oenocarpus bataua; oxidación de lipoproteínas; aceite de seje; aceite de oliva; oenocarpus bataua oxidation of lipoprotein; seje oil

ARCHIVOS LATINOAMERICANOS DE NUTRICION Vol. 61 No 2, 2011 Organo Oficial de la Sociedad Latinoamericana de Nutricion Maria Isabel Giacopini, Omaira Guerrero, Manuel Moya, Virgilio Bosch. Instituto de Medicina Experimental, Facultad de Medicina, Universidad Central de Venezuela. Universidad Pedagogica Experimental Libertador, Caracas - Venezuela poproteinas oxidadas (LDLox, HDLox) desempena un papel causal e importante en la aterogenesis (2-4). La susceptibilidad de la LDL a la oxidacion viene determinada por diversos factores endogenos y exogenos (5). Entre estos ultimos, los factores nutricionales revisten especial importancia, como los tipos de acidos grasos y compuestos antioxidantes de la dieta (6). Estudios realizados en animales y en pacientes hipercolesterolemicos, senalan que el consumo de dietas ricas en acidos grasos monoinsaturados (AGMI) y pobres en acidos grasos poliinsaturados (AGPI),enriquecen la LDL con acido oleico y resultan lipoproteinas mas resistentes a la oxidacion y producen menos die- INTRODUCCION El aumento de la velocidad de generacion de especies reactivas de oxigeno, unido a una disminucion de los mecanismos de defensa antioxidantes, conduce a un aumento en la concentracion de radicales libres (RL), o estres oxidativo, que constituye la base de la hipotesis oxidativa de la aterosclerosis (1). Estudios experimentales en modelos animales, epidemiologicos e investigaciones clinicas apoyan la hipotesis de que los cambios conformacionales de las lipoproteinas de baja densidad (LDL) y de alta densidad (HDL) son causadas por la peroxidacion lipidica, y que estas li- SUMMARY. Comparative study of the consumption of virgin olive oil or seje on lipid profile and oxidation resistance of high density lipoprotein (HDL) of rat plasma. We compared the effect of the consumption of seje oil (Oenocarpus bataua), with that of olive oil, on plasma lipids and susceptibility in vitro to oxidation of high density lipoprotein (HDL) in the rat. Two groups of ten male Sprague Dawley rats were fed ad libitum, for a lapse of eight week, with a purified diets with 10g de seje oil or olive oil/ 100 g of diet (GS y GO respectively). The animals were exsanguinated at the end of the experimental after a 14 hour fast. Plasma was isolated by centrifugation, and the fractions of lipoproteins were separated from the plasma by sequential ultracentrifugation. Rats of GO had a statistically significant lower in concentration of TG (p<0.05) compared with GS group. HDL fractions in both groups were oxidatively modified by incubation with copper ions. Differences in the fractions susceptibilities to peroxidation were studied by measuring the formation of thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) for 3 hours. HDL in GS had a statistically significant decrease in TBARS formation (p<0.05) relative to HDL of GO. This may be explained by the lower concentration of polyunsaturated fatty acids of HDL in GS compared with HDL in GO. Key words: Oenocarpus bataua oxidation of lipoprotein, seje oil. RESUMEN. Nosotros comparamos los efectos del consumo de aceite de seje (Oenocarpus bataua), con respecto el de oliva virgen sobre la concentracion de los lipidos del plasma y de la susceptibilidad de oxidacion in vitro de las lipoproteinas de alta densidad (HDL) en la rata Sprague Dawley. Dos grupos de 10 ratas macho, fueron alimentados ad libitum por un lapso de 8 semanas, con una dieta purificada que contenia 10g aceite de seje u oliva/100 g de dieta (GS y GO respectivamente). Se extrajo la sangre a los animales previo ayuno de 14 horas. El plasma fue aislado por centrifugacion, y las fracciones de lipoproteinas se separaron por ajuste de densidad y ultracentrifugaciones sucesivas. Las HDL de ambos grupos fueron oxidadas por incubacion con iones cobre. La diferencia de susceptibilidad de oxidacion de las HDL fue estudiada midiendo la formacion de sustancias reactivas al acido tiobarbiturico (TBARS) a las 3 horas. Las ratas del GO presentaron una disminucion estadisticamente significativa en la concentracion de los trigliceridos TG (p<0.05) comparada con las ratas del GS. Las HDL del GS experimentaron una disminucion estadisticamente significativa de la susceptibilidad de oxidacion de las HDL respecto las HDL GO. Esto puede ser atribuido a la mas baja concentracion de acidos grasos poliinsaturados (AGPI) en las HDL GS comparado con las HDL del GO. Palabras clave: Oenocarpus bataua, Oxidacion de lipoproteinas, aceite de seje, aceite de oliva. Estudio comparativo del consumo de aceite de oliva virgen o seje sobre el perfil lipidico y la resistencia a la oxidacion de las lipoproteinas de alta densidad (HDL) del plasma de rata. 143 grupos de 10 ratas/grupos (GS- GO) y alimentados ad libitum por un lapso de ocho semanas. La composicion de la dieta experimental se muestra en la Tabla 1. La dieta de cada uno de los grupos contiene 10g/100 de aceite, siendo las fuentes de acidos grasos los siguientes aceites: Grupo Seje (GS): aceite crudo de seje extraido mediante un procedimiento artesanal, que data de epocas anteriores a la conquista europea (14); de La Esmeralda, Druida Marahuaca, y Grupo Oliva (GO): aceite de oliva virgen comercial (Caracas, Venezuela). El consumo de la dieta y peso de los animales fue controlado diariamente durante el periodo que duro el experimento. Indices de calidad. Para las determinaciones de acidez y peroxidos, se siguio la metodologia descrita en los reglamentos: de la Comision Venezolana de Normas Industriales (COVENIN), a las muestras de los aceites se les determino: acidez libre oleica (titulacion volumetrica, COVENIN, 1996b) e indice de peroxidos (COVENIN, 1998) (15-16) Determinacion de la concentracion de tocoferoles en los aceites. La determinacion de los tocoferoles en los aceite, se hizo por cromatografia liquida (HPLC), segun el metodo de la AOCS, Ce 8-89 (17).El equipo empleado para la separacion y cuantificacion de los tocoferoles fue un cromatografo de liquidos con un detector de arreglo de diodos marca Perkin Elmer modelo 235C, y una columna marca Alltech fase normal silica, 250 mm x 4,6 mm x 5 micrones. La fase movil que se empleo en la separacion fue una mezcla de n-hexano- TABLA N‹1 Composicion de la dieta experimental.(g/100g) Componentes Composicion Caseina 22.47 Almidon de maiz 57.53 Aceite (Seje u Oliva) 10.0 Bitartrato de colina 0.2 Mezcla de minerales (AIN) 3.5 Mezcla de vitaminas (AIN) 1.0 DL-metionina 0.3 Recomendaciones de American Institute of Nutrition (AIN) nos conjugados (DC), peroxidos de lipidos (PL) , o malondialdehido(MDA), respecto a LDL ricas en AGPI. Esto se atribuye a que los AGPI poseen mayor numero de dobles enlaces susceptibles al ataque de los (RL), iniciadores de la reaccion en cadena de peroxidacion lipidica (7-8) Ademas, recientes investigaciones han determinado que el consumo de aceite de oliva rico en acido oleico, AGMI, tiende a reducir el riesgo cardiovascular relacionado con la concentracion plasmatica de TG, LDL-C, la relacion LDL-C: HDL-C, y la susceptibilidad de oxidacion de las LDL. (9-11) Estas observaciones reafirman la importancia de las grasas de la dieta para la prevencion de ECV, donde ha de considerarse el aceite de oliva como un componente nutricional importante de la misma, por su alto contenido de AGMI y de compuestos con propiedades antioxidantes. En este sentido, estudios realizados sobre las caracteristicas quimicas, fisicas y perfil de acidos grasos (AG) de diferentes tipos de aceites de consumo humano en Venezuela, detectaron que un aceite extraido por etnias venezolanas de la pulpa del fruto de una palma silvestre denominada Oenocarpus bataua, anteriormente denominada Jessenia bataua (12), y llamada comunmente en Venezuela gsejeh, (13), presenta una alta concentracion del acido oleico (80 g/100), lo que lo asemeja al aceite de oliva (14) A pesar, que el aceite de seje posee caracteristicas fisico-quimicas y composicion de AG similares al aceite de oliva, que permiten recomendarla para consumo humano, no se dispone de informacion cientifica sobre su efecto sobre factores de riesgo cardiovascular. Siendo el proposito de esta investigacion, comparar el efecto del consumo del aceite de seje con respecto el aceite de oliva, sobre el perfil lipidico y la susceptibilidad de oxidacion in vitro de la fraccion HDL de plasma de rata, con la finalidad de definir su utilidad desde el punto de vista de aceite con actividad antioxidante MATERIALES Y METODOS Animales y dietas. En este estudio se utilizaron un total de 20 ratas machos de la cepa Sprague Dawley, con un peso promedio de 200 } 20 g de peso. Los animales fueron colocados en jaulas individuales, y separados en dos 144 GIACOPINI et al. de HDL (n=10/Grupo) aisladas son desalinizadas (7). La concentracion de proteinas, se determino de acuerdo al metodo de Lowry modificado por Shacterlec y Pollack (22). La oxidacion de las HDL se indujo por la adicion de CuSO4 (7ƒÊM) segun metodo de Thomas, C., y col (23). A las 3 horas, se determino el grado de oxidacion de las HDL in vitro por el metodo propuesto por Kosugi, H y col (24). Los resultados son expresados como nmoles de SRTBA/mg de proteina. Determinacion del Indice de Peroxidabilidad (IP) A partir de la composicion de AG se calculo Indice de Peroxidabilidad (IP), el cual refleja la susceptibilidad de peroxidacion considerando el potencial de oxidacion de cada AG. (25) IP= (% AGMI*0.025)+ (% acido dienoico*1) + (% de AG trienoico* 2) + (%AG tetraenoico *4) + (% AG pentaenoico *6) + (% AG hexaenoico* 8) Analisis estadistico. Los resultados son presentados como promedios } desviacion estandar (D.E.). Se utilizaron para el analisis estadistico de las variables estudiadas, la prueba ANOVA de un factor, y la comparacion de las medias por la prueba de Turkey, considerandose significativo un valor de "p" inferior a 0,05. RESULTADOS. El peso promedio de las ratas alimentadas con las dietas que contenian 10 g/100 de aceite de seje u oliva, despues de las ocho semanas, fue 409}16 y 427} 12 g respectivamente, no se observo diferencia significativa en el crecimiento de las ratas entre los grupos. Los valores de acidez en las muestras correspondientes al aceite de seje y oliva estuvieron por debajo del 2%, que es el maximo establecido por la Norma para los aceites virgenes de oliva. En cuanto al Indice de Peroxidos, los resultados mostraron valores inferiores al limite maximo permitido por la norma COVENIN para aceite oliva virgen (<20 meq O2 Kg-1) (Tabla2). De los cuatro isomeros del tocoferol solo se detecto el ƒ¿- tocoferol, siendo la concentracion en el aceite de oliva el doble de la del aceite de seje, 22 ppm y 11ppm respectivamente (Tabla 2). El perfil de AG de los dos aceites indica que ambos presentan la misma concentracion de acido oleico, AGMI, diferenciandose en el porcentaje de los isopropanol 99,75:0,25 (v/v) con un flujo de 1 ml/min, y un volumen de inyeccion de 20 ƒÊL. Se empleo una longitud de onda de de 290 nm. Analisis de acidos grasos Los AG se extraen de acuerdo al metodo de Folch et al. (18). La composicion de AG fue determinada por cromatografia gas/ liquido despues de la transesterificacion de los AG con una mezcla metanol/tolueno /acido sulfurico en proporcion 86:10:4 e incubados por 90 min., a 80oC. (19). El porcentaje de los metil esteres de los acidos grasos (MAG) fueron determinados despues de su separacion utilizando un cromatografo de gases HP, modelo 6890 Plus GC, version A.03.07; con una columna capilar recubierta interiormente de una pelicula de cyanopropil 0, 2 ƒÊm, con una longitud de 100 m y un diametro interno de 0.25mm (HP-88). Obtencion del plasma. Despues de ocho semanas, los animales previo ayuno de 14 horas, fueron anestesiados con Neosdonal (Specia-Paris-Francia) por via intraperitoneal (5mg/100 g de peso corporal) y se extrajo la sangre por puncion cardiaca. La sangre fue colectada en tubos con 10 ƒÊl/mL de EDTA al 10%, y centrifugada a 2000 g por 15 min a 10oC. El plasma obtenido se conservo bajo refrigeracion a 4oC, hasta su procesamiento. Aislamiento de las lipoproteinas del plasma. Las diferentes fracciones de lipoproteinas del plasma VLDL (d<1.019 gr/ml), LDL (d= 1.019 . 1.063 gr/ml) y HDL (d= 1.063 .1.021 gr/ml) fueron separadas por ajuste de densidad con bromuro de potasio (KBr) y ultracentrifugaciones sucesivas por 20 horas a 40.000 rpm (100000 g) y temperatura 15‹C utilizando una ultracentrifuga marca Beckman, modelo L5 . 55, y un rotor Spinco 50 Ti, como se ha descrito anteriormente (20). Determinacion de las variables bioquimicas Se realizaron las determinaciones de trigliceridos totales y colesterol total y en las fracciones VLDL, LDL, y HDL por metodos enzimaticos-colorimetricos INVELAB. Determinacion del grado de oxidacion. Se determino el grado de oxidacion del plasma y de las HDL previo a la oxidacion (21). Las fracciones ESTUDIO COMPARATIVO DEL CONSUMO DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN O SEJE 145 significativa entre la concentracion de TG del GO respecto al GS (p<0.05). No se detectaron sustancias reactivas con el acido tiobarbiturico (SRTBA), en el plasma y en las fracciones de HDL de las ratas post periodo experimental (resultados no mostrados). En la Tabla 5 se observa la marcada diferencia entre los valores promedios } DE (p< 0.05), de la concentracion de los productos de oxidacion de las HDL de los GS y GO a las 3 horas de inducida la reaccion con CuSO4. DISCUSION El aceite de seje presento un valor de indice de acidez y de peroxidos inferiores a los valores permitidos por la Norma para el aceite de oliva virgen, asi como un Indice de Peroxidabilidad menor lo que indica una mayor estabilidad frente a la oxidacion que el aceite de oliva. La diferencia de concentracion del acido araquidonico (C20:4 n-6) y docosahexanoico (C22-6 n-3) de las HDL de ambos grupos, obedece a la diferencia de concentracion en las dietas de los precursores de estos AG, el acido linoleico (C18:2, n-6) y el ƒ¿- linolenico AGPI linoleico y linolenico. El aceite de seje presenta una relacion de W6/W3 de 6.04}0.33 a 13.06}0.38 en el aceite de oliva, proporcion que se mantiene en la dieta y en la fraccion de HDL (Tabla 3). Un hecho notorio es que la concentracion de acido araquidonico es menor en las HDL del GS respecto al GO y por lo tanto el IP de las HDL del GS es menor que el de las HDL GO (Tabla 3). Los lipidos al final del estudio se muestran en la Tabla 4. Se observo, una diferencia estadisticamente TABLA 2 Caracteristicas quimicas de los aceites de seje y oliva virgen Caracteristica Aceite de Seje Aceite de Oliva (V) Indice de Acidez (% Ac. Oleico) 0,70 } 0,03 0,46 } 0,03 Indice Peroxido (meq/Kg) 4.5}0.02 12.0 }0.08 ƒ¿- tocoferol (ppm) 11.0 22.0 Acidez aceite de oliva virgen 1 a 2% Ac. Oleico Indice Peroxido de aceite de oliva virgen <20 TABLA N‹ 3 Composicion de los acidos grasos de los aceites- dietas y HDL de las Ratas. (g/100g) Aceites Dietas HDL AG Seje Oliva Seje Oliva GS GO 16:00 8.43}0.09* 11.38}0.04 11.81}0.15 11.98}0.3 26.88}0.40 26.65}0.16 18:00 3.13}0.01 3.54}0.06 3.06}0.03 3.75}0.04 11.25}0.21 11.28}0.09 18: 1 Cis 81.18}0.06 81.01}0.01 75.06}1.41 74.07}0.02 35.23}0.46 34.90}0.21 18: 2 n-6 2.85}0.18* 8.29}0.02 3.69}0.09* 7.52}0.10 3.38}0.08* 7.60}0.04 18: 3n-6 1.42}0.15* 0.46}0.01 0.13}0.01* 0.44}0.02 0.50}0.10 0.61}0.01 18:3 n-3 0.67}0.04 0.74}0.01 0.71}0.00 0.71}0.01 0.14}0.00 0.14}0.00 20:4 n-6 ------ ------ ------ ------ 2.86}0.04* 6.72}0.04 20:5 n-3 ------ ------ ------ ------ ------- 0.12 }0.02 22: 6 n-3 ------ ------ ------ ------ 0.46}0.00 0.42}0.01 ƒ°AGS 11.56}0.01 14.89}0.01 16.81}0.08 15.73}0.02 45.40}0.7* 41.28}0.26 ƒ°AGMI 81.18}0.06 81.01}0.01 75.06}1.41 73.07}0.01 35.20}1.7 34.90}0.21 ƒ°AGPI 4.94}0.01* 10.41}0.08 4.52}0.08* 8.66}0.13 7.34}0.1* 14.94}0.08 W6/W3 6.04}0.33* 13.06}0.38 5.19}0.08* 11.28}0.06 13.56}0.73* 25.91} 0.48 IP 9.10}0.60* 13.65}0.06 7.23}0.04* 11.67}0.16 22.65}0.20* 39.07}0.16 Los valores de AG de los aceites y de las dietas representan la media } DE (n= 3) Los valores de las HDL representan la media } DE de tre s mezclas de (n= 9) * Indica que existe diferencia significativa p<0.05 IP es el Indice de Peroxidabilidad calculado a partir de la composicion de AG. 146 GIACOPINI et al. TABLA 4 Concentracion de lipidos en el plasma de las ratas (mg /dL) Grupo C total Trigliceridos VLD-C LDL-C HDL-C Seje 53.8 } 9.5 51.2 } 11.9* 3.6 } 0.5* 3.3 } 1.0 25.5 } 6.5 Oliva 54.0 } 13.3 39.6 } 9.6 2.6 } 2.7 3.4 } 2.4 22.2 } 5.1 Los valores representan el promedio } DE (n = 10 por grupo) (*) Indica que existen diferencias estadisticamente significativas entre los dos grupos, establecidos mediante la prueba ANOVA siendo significativo a p < 0,05. TABLA 5 Grado de oxidacion de la fraccion HDL de plasma de rata con dieta al 10% aceite seje u oliva a las 3horas (nmoles TBARS/ mg de proteina) GRUPO Seje Oliva Grado de Oxidacion (3horas) 4 } 0.94* 14 } 5.92 Los valores representan el promedio } DE (n = 10 por grupo) * Indica que existen diferencias estadisticamente significativas entre los grupos, establecidos mediante la prueba ANOVA, siendo significativo a p < 0,05. igual al aceite de oliva, presenta una menor relacion w6/w3 lo cual conduce a lipoproteinas con una concentracion menor de linoleico y araquidonico. Esto nos hace pensar que el consumo de aceite de seje puede producir metabolitos con menos actividad inflamatoria que el aceite de oliva. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen el apoyo financiero recibido del CDCH (P.I 09-5621-2007). Asi como la colaboracion de la Dra. Julia Flores por la orientacion prestada en la realizacion del mismo. Al Especialista de Servicios Analiticos Alexis Reyes del Laboratorio de Servicios Analiticos de Alimentos Polar por la determinacion de tocoferoles en los aceites utilizados en la dieta. REFERENCIAS 1. Navab M, Ananthramaiah GM, Reddy ST, Van Lenten BJ, Ansell BJ, Fonarow GC, Barter PJ The oxidation hypothesis of atherogenesis: the role of oxidized phospholipids. The regulation and remodeling of HDL by plasma factors. Atherosclerosis 2002; 3:39-47. 2. Witztum JL, Steinberg D. The oxidative modification hypothesis of atherosclerosis: does it hold for humans? Trends Cardiovasc Med. 2001; 11:93-102. 3. Aviram M. Modified forms of low density lipoprotein and atherosclerosis. Atherosclerosis 1993; 98: 1-9. 4. Streinbrecher UP, Zhang H, Lougheed M. Role of oxidative modified LDL in atherosclerosis. Free Radical Biology y Medicine 1990; 9: 155 . 168. 5. Diplock AT. Antioxidant nutrients and disease prevention: an overview. Am. J. Clin Nutr.1991; 53: 189 S - 193 S. 6. 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La disminucion de la concentracion de los TG por el consumo de aceite de oliva virgen es consistente con estudios previos. Se ha demostrado que el aceite de oliva contribuye a modular los procesos metabolicos relativos a la secrecion y al transporte de trigliceridos. (27) Ademas, existen evidencias de que el aceite de oliva genera lipoproteinas intestinales ricas en trigliceridos que se metabolizan con rapidez (28) La ausencia de TBARS en el plasma y las fracciones de HDL de ambos grupos despues del periodo experimental, nos permite concluir que hay un balance oxidativo/ antioxidativo en plasma y HDL antes de inducir la reaccion de oxidacion. Un hallazgo muy notorio e importante de este trabajo es en la menor susceptibilidad a la oxidacion in vitro de las HDL del GS, en comparacion a las HDL GO (p<0.05). Todo esto muy de acuerdo con las diferencias que existen en cuanto al contenido de AGPI e IP de las dietas utilizadas y las HDL (7-9). Estos resultados indican que el aceite de seje, a pesar de poseer una concentracion de acido oleico ESTUDIO COMPARATIVO DEL CONSUMO DE ACEITE DE OLIVA VIRGEN O SEJE 147 20. Havel, R., Eder, H.A., y Bragdon, J.H. The distribution and chemical composition of ultracentrifugally separated lipoproteins in human serum. J Clin Invest. 1955; 4: 1345 .1353. 21. Feldman E. Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) Assay. Animal Models of Diabetic Complications Consortium (AMDCC) Protocols. Disponible en http://www.amdcc.org/shared/showFile.aspx? doctypeid=3&docid=33 22. Schacterle G Y Pollack R. A simplified method for the quantitative assay of small amounts of protein in biological material. Anal. Biochem. 1973; 51: 654 . 6655. 23. Thomas, C.E., y Jackson, R.L. Lipid hhydroperoxide involvement in copper . dependent and independent oxidation of low density lipoproteins. J. Pharmacol . Exp. . Ther. 1991; 256: 11182 . 1188. 24. Kosugi, H., Kojima, T., y Kikugawa, K. 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