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REVISTA: Archivos Latinoamericanos de Nutrición

NUMERO: Año 2012, Volumen 62 Número 1

TITULO: Notas Necrológicas

AUTORES: Maria Luz Pita Martin de Portela

RESUMEN: Listeria monocytogenes es una bacteria responsable de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA).

PALABRAS CLAVE: listeria monocytogenes; aloe vera; concentración mínima inhibitoria; tiempo mínimo de inhibición; listeria monocytogenes; aloe vera; minimum inhibitory concentration; time of minimum inhibition

73 Efecto bacteriostatico y/o bactericida del extracto de gel de Aloe vera sobre cultivos de Listeria monocytogenes. RESUMEN. Listeria monocytogenes es una bacteria responsable de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA). Para comprobar el efecto del extracto de gel de Aloe vera, como posible agente bacteriostatico y/o bactericida sobre Listeria monocytogenes, se determino la concentracion minima inhibitoria (CMI), el tiempo minimo de inhibicion (TMI) y la concentracion bactericida minima (CBM) de soluciones de extracto de gel de Aloe vera en diferentes concentraciones sobre cultivos de Listeria monocytogenes ATCC 7635. Se aplico el metodo de difusion en agar, utilizando soluciones del extracto de gel de Aloe vera en concentraciones de 0 a 100% para la CMI. El TMI se determino por curvas de crecimiento en caldo Soya tripticasa con un inoculo inicial de Listeria monocytogenes ATCC 7635 de 108 UFC por mL en cada solucion. Se pudo determinar que la CMI fue del 10% de extracto de gel de Aloe vera y el TMI fue de 5 horas en las concentraciones de 10%, 20% y 30% de Aloe vera, mientras que a las concentraciones de 50, 80, 90 y 100%, el tiempo fue de 8 horas. Se comprobo que efectivamente el gel de Aloe vera tiene poder bacteriostatico sobre Listera monocytogenes (p<0.001), mas sin embargo, no se obtuvo un efecto bactericida en los ensayos realizados. Palabras clave: Listeria monocytogenes, Aloe vera, concentracion minima inhibitoria, tiempo minimo de inhibicion SUMMARY. Bacteriostatic and/or bactericidal extract of Aloe vera gel on cultures of Listeria monocytogenes. Listeria monocytogenes is a bacteria responsible for food borne diseases (FBD) The effect of Aloe vera gel extract as a possible bacteriostatic and / or bactericidal against Listeria monocytogenes, was checked by determined the minimum inhibitory concentration (MIC), the time of minimum inhibition (TMI) and minimum bactericidal concentration (MBC) solutions extract of Aloe vera gel in different concentrations on cultures of Listeria monocytogenes ATCC 7635. We applied the agar diffusion method, using solutions of extract of Aloe vera gel at concentrations of 0 to 100% for the MIC. The TMI was determined by growth curves in trypticase soy broth with an initial inoculum of Listeria monocytogenes ATCC 7635 of 108 CFU/mL in each solution. It was determined that the MIC was 10% extract of Aloe vera gel and TMI was 5 hours at concentrations of 10%, 20% and 30% of Aloe vera, while concentrations of 50, 80, 90 and 100%, the time was 8 hours. It was found that indeed the Aloe vera gel is bacteriostatic power on Listeria monocytogenes (p <0.001), but yet, no bactericidal effect was obtained in our study. Key words: Listeria monocytogenes, Aloe vera, minimum inhibitory concentration, time of minimum inhibition Luis Guillermo Ramirez Merida, Alba Moron de Salim, Rosangela Catinella, Luis Castillo Departamento de Biologia, Facultad de Ciencias y Tecnologia (FACYT). Escuela de Ciencias Biomedicas y Tecnologicas. Instituto de Investigaciones en Nutricion (INVESNUT). Escuela de Bioanalisis, Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad de Carabobo, Sede Valencia. Venezuela ARCHIVOS LATINOAMERICANOS DE NUTRICION Organo Oficial de la Sociedad Latinoamericana de Nutricion Vol. 62 No 1, 2012 INTRODUCCION La incidencia global de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) es dificil de estimar; sin embargo para el 2005, la Organizacion Mundial para la Salud (OMS), reporto cerca de 1,8 millones de personas que murieron por enfermedades diarreicas, con una considerable proporcion de estos casos atribuidos a alimentos y aguas contaminadas. En los paises industrializados, el porcentaje de la poblacion afectada por ETA se estima en un 30%, mientras que en los paises en vias de desarrollo su incidencia puede ser mayor (1). Listeria monocytogenes, es responsable de ETA y agente etiologico de la listeriosis, infeccion gastrointestinal invasiva cuyas manifestaciones clinicas dependen del estado de la persona infectada: pacientes inmunosuprimidos, mujeres embarazadas, neonatos y personas de edad avanzada (2). El inoculo exacto y el periodo de incubacion son desconocidos; se cree que se necesitan mas de 103 microorganismos y entre 11 y 70 dias para que se produzca la infeccion invasiva (3). La listeriosis no ocurre muy a menudo; para el 2001 la incidencia oscilo entre 0,3 a 7,5 casos por millon de personas en Europa (4); en Australia fue de 3 casos por millon de personas para el 2003 (5). En 74 RAMIREZ MERIDA et al. Venezuela no se han confirmado casos de listeriosis, sin embargo, entre los datos disponibles de ETA, se reportaron 37 brotes entre 950 personas afectadas para el 2003 (6). Si bien es cierto que la incidencia anual de listeriosis puede parecer relativamente baja en comparacion con otras ETA, hay que considerar que esta patologia se ha posicionado como una de las enfermedades transmitidas por alimentos mas importante, debido al aumento de la poblacion susceptible, las implicaciones a nivel clinico y su alta tasa de letalidad, asi como la ubicuidad de Listeria monocytogenes. Se ha evidenciado que los acidos organicos como el acido lactico y el acido acetico, generalmente usados en los alimentos para el control de microorganismos, provocan acido tolerancia en Listeria monocytogenes; de alli que esta bacteria sea de interes, por su gran resistencia y capacidad de adaptacion a diferentes medios (7-9). Aunado a la capacidad de sobrevivir en ambientes hostiles, Listeria monocytogenes posee rasgos fenotipicos que actuan como factores de virulencia. Listeria monocytogenes, emerge hoy en dia, como uno de los microorganismos de mayor riesgo para las poblaciones susceptibles y responsable de brotes en diversas partes del mundo. En este sentido y con la intension de aportar medios sencillos y eficaces que permitan reducir al minimo la cantidad de Listeria monocytogenes en los alimentos, se propone la utilizacion de soluciones de extracto de gel de Aloe vera como sustancia no toxica y con un potencial bacteriostatico y/o bactericida sobre Listeria monocytogenes (10). Aloe vera, posee hojas que contienen una pulpa o parenquima incoloro que forma el gel/cristal del Aloe, el cual representa aproximadamente el 65 a 80% del peso de la planta. Este gel esta conformado por carbohidratos que son sintetizados en exceso, agua, minerales y acido malico almacenado. Los polisacaridos mucilaginosos son los principios activos responsables de la actividad biologica del gel (11-13); en tal sentido, se ha demostrado una cierta actividad antimicrobiana del gel frente a diferentes microorganismos como Trichophyton mentagrophytes, Staphylococcus aureus y Candida albicans (14,15). Considerando el comprobado efecto inhibitorio que posee el gel de Aloe vera sobre los microorganismos, se propuso evaluar el efecto bacteriostatico y/o bactericida que pudiese tener el extracto de gel de Aloe vera frente a Listeria monocytogenes, ya que el gel/cristal de Aloe vera es de naturaleza comestible y no altera considerablemente las propiedades organolepticas de los alimentos, por lo que, demostrar que posee un efecto bacteriostatico y/o bactericida frente a Listeria monocytogenes podria dar paso a su utilizacion como biopreservante, proporcionando medios alternativos en pro de mejorar la calidad microbiologica de los alimentos. De igual forma, serian excelentes alternativas naturales y economicas frente a los biopreservantes quimicos usados en la actualidad. MATERIALES Y METODOS Investigacion de campo, donde se evaluo el efecto bacteriostatico y/o bactericida de soluciones del extracto de gel de Aloe vera, que actuaron sobre cultivos de Listeria monocytogenesATCC 7635, cepas donadas por el Laboratorio de Biotecnologia de la Facultad de Ciencias y Tecnologias FACYT, de la Universidad de Carabobo. Procedimiento Metodologico Obtencion del extracto de gel de Aloe vera. Las muestras (pencas) fueron donadas por la Facultad de Agronomia de la Universidad Central de Venezuela (nucleo Maracay, Edo. Aragua). Las pencas fueron cortadas de la base de la planta Aloe vera de aproximadamente dos (2) anos de edad; se lavaron con agua y un agente tensoactivo, y se enjuagaron con una solucion yodada al 2%; luego se procedio al despunte y descortezado de las mismas para la extraccion del ge l/cristal. El gel/cristal fue lavado por aspersion de agua y escurrimiento, para eliminar el acibar secretado por la corteza al ser excluida. Luego, el gel/cristal fue comprimido para obtener el jugo o mucilago, el cual se filtro mediante el empleo de un filtro a presion manual y 25 oC de temperatura; el filtrado se centrifugo a 15000 rpm, en una centrifuga Avanti Centrifuge J-26 XP, a 37‹C con la intension de eliminar solidos en suspension y disminuir la viscosidad; una vez clarificado el mucilago, se procedio a pasteurizarlo a 50‹C durante 2 horas, y se concentro hasta 50% de su volumen inicial. Para ello se utilizo un concentrador al vacio Eppendorf 5301, manteniendo una temperatura de 45‹C durante 90 min. Con el extracto concentrado de gel de Aloe vera se prepararon soluciones de concentracion del 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100%, respectivamente, con agua esteril, para los ensayos posteriores. EFECTO BACTERIOSTATICO Y/O BACTERICIDA DEL EXTRACTO DE GEL DE ALOE VERA 75 Preparacion del inoculo. A partir de un cultivo original de L. monocytogenes ATCC 7635 de 24 h/overnight, se tomo con una asa de platino y se sembro en placas de agar nutritivo, incubandose a 35‹C por un periodo de 4 a 6 horas, para lograr la fase logaritmica. Posteriormente y a partir de una colonia aislada se tomo con el asa y se preparo una suspension con agua esteril, ajustando la densidad de la suspension del cultivo por comparacion de su turbidez con un estandar de 0,5 de Mc Farland de BaSO4, mediante este procedimiento se garantizo un inoculo inicial de 108 UFC/mL de Listeria monocytogenes. Metodo de difusion en Agar segun Kirby Bauer. Para esta prueba se prepararon placas de Petri con agar PALCAM con un grosor de 6 mm en cada placa. Una vez solidificado el agar, se impregnaron hisopos esteriles con la solucion de Listeria monocytogenes ATCC 7635 y se procedio a inocular cada una de las placas, cubriendo todo el espacio disponible, hasta obtener una distribucion uniforme de las colonias. Por otro lado, discos de papel de filtro Watman N‹ 54, con diametro de 6 mm, y esteriles, fueron impregnados con las soluciones de concentraciones especificas de extracto de gel de Aloe vera, previamente preparadas, y se colocaron en las placas inoculadas anteriormente; se colocaron cinco (5) discos de concentraciones diferentes de extracto de Aloe vera por placa inoculada. Las placas fueron incubadas a 37‹C, se observaron a las 24 y 48 horas de incubacion. Los halos de inhibicion alrededor de los discos, fueron medidos con un vernier tomando dos medidas por cada disco promediandose; los ensayos se llevaron a cabo por duplicado. Como patron de referencia, de los antibiogramas, se utilizaron discos de Ampicilina y Gentamicina especificos para la inhibicion de Listeria en concentraciones de 10 ƒÊg respectivamente. Determinacion del tiempo minimo de inhibicion. La determinacion del tiempo minimo de inhibicion se realizo midiendo el crecimiento bacteriano, para ello se prepararon 7 frascos Erlenmeyer de 50 mL, identificados del 1 al 7, a cada una se les vertio 10 mL de caldo nutritivo esteril; seguidamente al frasco No 1 se le agregaron 10 mL de extracto de Aloe vera al 10%; al frasco No 2, 10 mL de extracto de Aloe vera al 20%, y realizando el mismo procedimiento para las concentraciones 30%, 50%, 80%, 90%, 100% respectivamente; se preparo un frasco control con 10 mL de caldo nutritivo. Cada uno de los frasco fueron inoculados con 0,1 mL de suspension de 107 UFC/mL de Listeria monocytogenesATCC 7635; inmediatamente se procedio a medir la absorbancia con un espectrofotometro Thermo Spectronic Genesys UV, a 540 nm (tiempo 0). Posteriormente los frascos inoculados se incubaron a 37‹C midiendo la absorbancia a intervalos de una hora hasta transcurridas 12 horas desde la primera medicion. Los datos obtenidos fueron graficados para obtener las curvas de crecimiento respectivas. Se comparo la curva resultante de cada concentracion de la solucion de Aloe vera con la curva de 0%, a fin de evidenciar diferencias significativas en el crecimiento de Listeria monocytogenes. Todos los experimentos se realizaron por duplicado. Concentracion Minima Bactericida. De los frascos preparados para la prueba de Tiempo Minimo de Inhibicion, se tomo una asada y se sembro en una placa de Petri con agar Palcam, se incubaron a 37‹C durante 24h. Luego de las 24h se observaron las placas y se selecciono aquella en la que no hubo crecimiento bacteriano. La concentracion de la solucion de Aloe vera en la que no hubo crecimiento bacteriano en la placa fue tomada como la concentracion bactericida minima. Analisis de los Datos. Los datos relativos a la formacion o no del halo de inhibicion microbiologico, asi como el diametro del halo, fueron por duplicado y se promediaron. Se procesaron a traves de un analisis descriptivo (media aritmetica) y se construyeron diagramas de cajas y aristas (BOX & WHISKER PLOT) en relacion a la media de los halos de inhibicion obtenidos. Para determinar cambios en la dinamica de crecimiento en Listeria monocytogenes, de acuerdo a las concentraciones del extracto de gel de Aloe vera usadas en el estudio, se promediaron y se graficaron las densidades opticas obtenidas, a fin de presentar las respectivas curvas de crecimiento microbiano, comparando cada uno de los tratamientos mediante la aplicacion de la prueba de correlacion de Spearman (prueba no parametrica) que mide la diferencia entre una distribucion observada y otra esperada). Los datos fueron procesados a traves del programa estadistico STATISTIX 9.0.0. RESULTADOS Los resultados obtenidos durante la realizacion de los ensayos propuestos para evaluar el efecto bacterios76 RAMIREZ MERIDA et al. tatico y/o bactericida del extracto de gel de Aloe vera en cultivos de Listeria monocytogenesATCC 7635, en comparacion con los halos de inhibicion de los patrones de referencia de antibioticos (0,5 mm), mostraron que los halos de inhibicion promedio, obtenidos con las diferentes concentraciones del extracto de gel de Aloe vera, fueron de 1,5 mm para las concentreaciones de 10 a 40% respectivamente, asi como de igual magnitud para las concentraciones 60,70 y 100%, mientras que se pudo observar una tendencia inhibitoria superior en la concentracion del 90%, segun se evidencia en la figura de caja y aristas (Figura 1). La Figura 2, muestra la curva de crecimiento de Listeria monocytogenes en condiciones normales de caldo nutritivo y curvas de crecimiento del microorganismo en soluciones de Aloe vera a diferentes porcentajes de concentracion y medidas por densidad optica. La curva normal de crecimiento sin Aloe vera (0%), muestra el comportamiento esperado: una fase de latencia o adaptacion la cual se inicia luego de la inoculacion del microorganismo culminando aproximadamente a las 4 horas; seguidamente una fase logaritmica o exponencial hasta alcanzar su pico maximo de multiplicacion a las 8 horas de incubacion para mantenerse en fase estacionaria hasta el final de las mediciones. Las curvas de crecimiento del microorganismo a las diferentes concentraciones del extracto de Aloe vera evidencian un patron de crecimiento que sigue la tendencia de fase de latencia que, para las soluciones con concentraciones del ex- FIGURA 1 Diagrama de cajas y aristas (BOX & WHISKER PLOT) por grupo con relacion al diametro del halo de inhibicion de los discos en el cultivo de Listeria monocytogenes en presencia del extracto de gel de Aloe vera. FIGURA 2 Curva de crecimiento bacteriano de Listeria monocytogenes ATCC 7635, a diferentes concentraciones del extracto de gel de Aloe vera. EFECTO BACTERIOSTATICO Y/O BACTERICIDA DEL EXTRACTO DE GEL DE ALOE VERA 77 tracto de 10, 20 y 30% respectivamente finaliza a las 2 horas, mientras que para las concentraciones de 50, 80, 90 y 100% finaliza a las 4 horas; la fase logaritmica o exponencial se mantiene desde las 2 horas hasta las 5 horas para las concentraciones de 10, 20 y 30% y a partir de este momento se mantiene en fase estacionaria hasta el final de las mediciones realizadas. Por otro lado, para las concentraciones de 50, 80, 90 y 100% de extracto de Aloe vera la fase logaritmica o exponencial del crecimiento del microorganismo comienza despues de 4 horas de incubacion y se mantiene hasta las 8 horas, con una declinac ion leve del crecimiento, por lo que se puede considerar que entra en fase estacionaria, y luego continuar un crecimiento hasta las 11 horas. DISCUSION Los resultados obtenidos en la prueba de correlacion de Spearman, evidenciaron que al comparar la curva de crecimiento normal respecto a las distintas soluciones de concentraciones de Aloe vera, existe una diferencia estadisticamente significativa (p < 0,01). En la grafica de crecimineto microbiano, resultante de la aplicacion de Aloe vera, se pueden observar que las tres fases de crecimiento se lograron en un menor tiempo, respecto a la curva control (0%). Este comportamiento pudiera deberse a la presencia de ciertas sustancias contenidas en el gel de Aloe vera, que pudieron favorecer el crecimiento de la bacteria, tales como: minerales, vitaminas, proteinas, iones y como principal carbohidrato, la glucosa (12). Sin embargo, a pesar de este favorecimiento, las curvas de crecimientos resultantes para cada una de las concentraciones de Aloe vera utilizadas, muestran picos de absorbancias muy por debajo al obtenido en la curva control, demostrando esto, que a pesar de que se alcanzo la fase exponencial rapidamente, las diferentes concentraciones de gel Aloe vera, interfirio en el crecimiento de Listeria, que pudo ser debido a la presencia de ciertos factores inhibidores presentes en el gel (14). Agary y col. (14), demostraron que el gel del Aloe vera posee efectos inhibitorios sobre otros microorganismos, tales como Staphylococcus aureus y Trichophyton mentagrophytes, efecto que no lograron al aplicar extractos de la penca sobre los mismos cultivos, sugiriendo que existen constituyentes del gel de la penca que no estan presentes en la corteza de la misma y que tienen un potencial antimicrobiano importante, no solo para cierto tipos de microorganismos, sino para diferentes bacterias e incluso hongos, de tal manera que a lo demostrado en trabajos precedentes, se une lo logrado en la presente investigacion, al demostrarse la existencia de una accion bactericida sobre Listeria monocytogenes. Adicional al efecto inhibitorio que el gel de Aloe vera tiene sobre algunos microorganismos, existen trabajos que reportan efectos positivos de ciertos componentes purificados de este gel, tal como es el caso del acemanano, uno de los principales componentes polisacaridos que estan presentes en el gel de la planta y que segun investigaciones, permite potenciar la actividad inmunomoduladora, al incrementar la sensibilidad de los macrofagos, aumentando la superficie de expresion molecular (16). Por otra parte, tambien se ha identificado que dicha sustancia, el acemanano, tiene la facultad de inhibir la adherencia de Pseudomona aeruginosa a las celulas epiteliales del pulmon en humanos (17), por lo que se amplian los descubrimientos sobre los efectos de este carbohidrato del que el gel de Aloe vera es tan rico. Si bien el gel de Aloe vera posee muchos otros componentes, no se debe dejar a un lado la posibilidad de que el acemanano sea responsable, entre otras cosas, del efecto bacteriostatico sobre Listeria monocytogenes, reflejado en el presente trabajo. Se pudo demostrar que el extracto del gel de Aloe vera posee cierto efecto bacteriostatico sobre Listeria monocytogenes, requiriendo para ello una concentracion minima de 10% del mismo. Asimismo, se pudo observar en las curvas de crecimiento que no se logro un efecto bactericida, por cuanto en cada una de ellas la bacteria logro desarrollarse en mayor o menor medida. El tiempo requerido para observar el efecto inhibitorio del gel de Aloe vera sobre Listeria monocytoges, fue de 5 horas para las diferentes concentraciones del extracto de gel de Aloe vera, con un efecto bacteriostatico estadisticamente significativo (p<0,01), aunque el efecto no fue directamente proporcional al aumento de su concentracion. Se puede inferir que el gel de Aloe vera tiene potencial para ser sugerido como biopreservante en la industria alimenticia, evitando de esta manera la proliferacion de Listeria monocytogenes, como un patogeno emergente, con capacidad de afectar a un seg78 RAMIREZ MERIDA et al. mento importante de la poblacion, principalmente los mas susceptibles. Se recomienda la realizacion de estudios donde se lleve a cabo la correlacion de los halos de inhibicion obtenidos del extracto de gel de Aloe vera con otros compuestos con capacidad antibacteriana a diferentes concentraciones, en el que la bacteria en estudio resulte sensible, para de esta manera discernir mejor el efecto bacteriostatico de Aloe vera y tener un marco de referencia comparativo. De igual forma se sugiere la utilizacion del extracto de gel de Aloe vera liofilizado, siendo esta una buena alternativa de concentracion de esta sustancia que pudiera ofrece mejores y mayores resultados sobre Listeria monocytoges y demas patogenos alimentarios. REFERENCIAS 1. Organizacion Mundial para la Salud OMS. Food safety and foodborne illness 2007. Disponible en: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs237/en/ [Consulta: 2011, Febrero 24]. 2. Vazquez-Boland J, Kuhn M, Berche P, Chakraborty T, Dominguez-Bernal G, Goebel W, et al. Listeria Pathogenesis and Molecular Virulence Determinants. Clinical Microbiology Reviews 2001; 4 (3): 584.640. 3. Salas, J. Listeriosis, una infeccion poco frecuente 2002 Disponible en: http://www.consumer.es/seguridad-alimentaria/ ciencia-y-tecnologia/2002/01/15/ 629.php [Consulta: 2010, Noviembre 25]. 4. De Valk H, Jacquet C, Goulet V, Vaillant V, Perra A, Desenclos JC et al. 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