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Efecto bacteriostatico y/o bactericida del extracto de gel
de Aloe vera sobre cultivos de Listeria monocytogenes.
RESUMEN. Listeria monocytogenes es una bacteria responsable
de enfermedades transmitidas por alimentos (ETA).
Para comprobar el efecto del extracto de gel de Aloe vera,
como posible agente bacteriostatico y/o bactericida sobre
Listeria monocytogenes, se determino la concentracion minima
inhibitoria (CMI), el tiempo minimo de inhibicion
(TMI) y la concentracion bactericida minima (CBM) de soluciones
de extracto de gel de Aloe vera en diferentes concentraciones
sobre cultivos de Listeria monocytogenes
ATCC 7635. Se aplico el metodo de difusion en agar, utilizando
soluciones del extracto de gel de Aloe vera en concentraciones
de 0 a 100% para la CMI. El TMI se determino
por curvas de crecimiento en caldo Soya tripticasa con un
inoculo inicial de Listeria monocytogenes ATCC 7635 de
108 UFC por mL en cada solucion. Se pudo determinar que
la CMI fue del 10% de extracto de gel de Aloe vera y el TMI
fue de 5 horas en las concentraciones de 10%, 20% y 30%
de Aloe vera, mientras que a las concentraciones de 50, 80,
90 y 100%, el tiempo fue de 8 horas. Se comprobo que efectivamente
el gel de Aloe vera tiene poder bacteriostatico
sobre Listera monocytogenes (p<0.001), mas sin embargo,
no se obtuvo un efecto bactericida en los ensayos realizados.
Palabras clave: Listeria monocytogenes, Aloe vera, concentracion
minima inhibitoria, tiempo minimo de inhibicion
SUMMARY. Bacteriostatic and/or bactericidal extract
of Aloe vera gel on cultures of Listeria monocytogenes.
Listeria monocytogenes is a bacteria responsible for food
borne diseases (FBD) The effect of Aloe vera gel extract
as a possible bacteriostatic and / or bactericidal against Listeria
monocytogenes, was checked by determined the minimum
inhibitory concentration (MIC), the time of
minimum inhibition (TMI) and minimum bactericidal concentration
(MBC) solutions extract of Aloe vera gel in different
concentrations on cultures of Listeria monocytogenes
ATCC 7635. We applied the agar diffusion method, using
solutions of extract of Aloe vera gel at concentrations of 0
to 100% for the MIC. The TMI was determined by growth
curves in trypticase soy broth with an initial inoculum of
Listeria monocytogenes ATCC 7635 of 108 CFU/mL in
each solution. It was determined that the MIC was 10% extract
of Aloe vera gel and TMI was 5 hours at concentrations
of 10%, 20% and 30% of Aloe vera, while concentrations
of 50, 80, 90 and 100%, the time was 8 hours. It was found
that indeed the Aloe vera gel is bacteriostatic power on Listeria
monocytogenes (p <0.001), but yet, no bactericidal effect
was obtained in our study.
Key words: Listeria monocytogenes, Aloe vera, minimum
inhibitory concentration, time of minimum inhibition
Luis Guillermo Ramirez Merida, Alba Moron de Salim, Rosangela Catinella, Luis Castillo
Departamento de Biologia, Facultad de Ciencias y Tecnologia (FACYT). Escuela de Ciencias Biomedicas
y Tecnologicas. Instituto de Investigaciones en Nutricion (INVESNUT). Escuela de Bioanalisis,
Facultad de Ciencias de la Salud. Universidad de Carabobo, Sede Valencia. Venezuela
ARCHIVOS LATINOAMERICANOS DE NUTRICION
Organo Oficial de la Sociedad Latinoamericana de Nutricion
Vol. 62 No 1, 2012
INTRODUCCION
La incidencia global de enfermedades transmitidas
por alimentos (ETA) es dificil de estimar; sin embargo
para el 2005, la Organizacion Mundial para la Salud
(OMS), reporto cerca de 1,8 millones de personas que
murieron por enfermedades diarreicas, con una considerable
proporcion de estos casos atribuidos a alimentos
y aguas contaminadas. En los paises
industrializados, el porcentaje de la poblacion afectada
por ETA se estima en un 30%, mientras que en
los paises en vias de desarrollo su incidencia puede ser
mayor (1).
Listeria monocytogenes, es responsable de ETA y
agente etiologico de la listeriosis, infeccion gastrointestinal
invasiva cuyas manifestaciones clinicas dependen
del estado de la persona infectada: pacientes
inmunosuprimidos, mujeres embarazadas, neonatos y
personas de edad avanzada (2). El inoculo exacto y el
periodo de incubacion son desconocidos; se cree que
se necesitan mas de 103 microorganismos y entre 11 y
70 dias para que se produzca la infeccion invasiva (3).
La listeriosis no ocurre muy a menudo; para el
2001 la incidencia oscilo entre 0,3 a 7,5 casos por
millon de personas en Europa (4); en Australia fue de
3 casos por millon de personas para el 2003 (5). En
74 RAMIREZ MERIDA et al.
Venezuela no se han confirmado casos de listeriosis,
sin embargo, entre los datos disponibles de ETA, se
reportaron 37 brotes entre 950 personas afectadas para
el 2003 (6).
Si bien es cierto que la incidencia anual de listeriosis
puede parecer relativamente baja en comparacion
con otras ETA, hay que considerar que esta patologia
se ha posicionado como una de las enfermedades
transmitidas por alimentos mas importante, debido al
aumento de la poblacion susceptible, las implicaciones
a nivel clinico y su alta tasa de letalidad, asi como la
ubicuidad de Listeria monocytogenes.
Se ha evidenciado que los acidos organicos como
el acido lactico y el acido acetico, generalmente usados
en los alimentos para el control de microorganismos,
provocan acido tolerancia en Listeria monocytogenes;
de alli que esta bacteria sea de interes, por su gran resistencia
y capacidad de adaptacion a diferentes medios
(7-9). Aunado a la capacidad de sobrevivir en ambientes
hostiles, Listeria monocytogenes posee rasgos fenotipicos
que actuan como factores de virulencia.
Listeria monocytogenes, emerge hoy en dia, como
uno de los microorganismos de mayor riesgo para las
poblaciones susceptibles y responsable de brotes en diversas
partes del mundo. En este sentido y con la intension
de aportar medios sencillos y eficaces que
permitan reducir al minimo la cantidad de Listeria monocytogenes
en los alimentos, se propone la utilizacion
de soluciones de extracto de gel de Aloe vera como sustancia
no toxica y con un potencial bacteriostatico y/o
bactericida sobre Listeria monocytogenes (10).
Aloe vera, posee hojas que contienen una pulpa o
parenquima incoloro que forma el gel/cristal del Aloe,
el cual representa aproximadamente el 65 a 80% del
peso de la planta. Este gel esta conformado por carbohidratos
que son sintetizados en exceso, agua, minerales
y acido malico almacenado. Los polisacaridos
mucilaginosos son los principios activos responsables
de la actividad biologica del gel (11-13); en tal sentido,
se ha demostrado una cierta actividad antimicrobiana
del gel frente a diferentes microorganismos como Trichophyton
mentagrophytes, Staphylococcus aureus y
Candida albicans (14,15).
Considerando el comprobado efecto inhibitorio que
posee el gel de Aloe vera sobre los microorganismos,
se propuso evaluar el efecto bacteriostatico y/o bactericida
que pudiese tener el extracto de gel de Aloe vera
frente a Listeria monocytogenes, ya que el gel/cristal
de Aloe vera es de naturaleza comestible y no altera
considerablemente las propiedades organolepticas de
los alimentos, por lo que, demostrar que posee un
efecto bacteriostatico y/o bactericida frente a Listeria
monocytogenes podria dar paso a su utilizacion como
biopreservante, proporcionando medios alternativos
en pro de mejorar la calidad microbiologica de los alimentos.
De igual forma, serian excelentes alternativas
naturales y economicas frente a los biopreservantes
quimicos usados en la actualidad.
MATERIALES Y METODOS
Investigacion de campo, donde se evaluo el efecto
bacteriostatico y/o bactericida de soluciones del extracto
de gel de Aloe vera, que actuaron sobre cultivos
de Listeria monocytogenesATCC 7635, cepas donadas
por el Laboratorio de Biotecnologia de la Facultad de
Ciencias y Tecnologias FACYT, de la Universidad de
Carabobo.
Procedimiento Metodologico
Obtencion del extracto de gel de Aloe vera. Las
muestras (pencas) fueron donadas por la Facultad de
Agronomia de la Universidad Central de Venezuela
(nucleo Maracay, Edo. Aragua). Las pencas fueron cortadas
de la base de la planta Aloe vera de aproximadamente
dos (2) anos de edad; se lavaron con agua y un
agente tensoactivo, y se enjuagaron con una solucion
yodada al 2%; luego se procedio al despunte y descortezado
de las mismas para la extraccion del ge |
l/cristal.
El gel/cristal fue lavado por aspersion de agua y escurrimiento,
para eliminar el acibar secretado por la corteza
al ser excluida. Luego, el gel/cristal fue
comprimido para obtener el jugo o mucilago, el cual
se filtro mediante el empleo de un filtro a presion manual
y 25 oC de temperatura; el filtrado se centrifugo a
15000 rpm, en una centrifuga Avanti Centrifuge J-26
XP, a 37‹C con la intension de eliminar solidos en suspension
y disminuir la viscosidad; una vez clarificado
el mucilago, se procedio a pasteurizarlo a 50‹C durante
2 horas, y se concentro hasta 50% de su volumen inicial.
Para ello se utilizo un concentrador al vacio Eppendorf
5301, manteniendo una temperatura de 45‹C
durante 90 min. Con el extracto concentrado de gel de
Aloe vera se prepararon soluciones de concentracion
del 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100%, respectivamente,
con agua esteril, para los ensayos posteriores.
EFECTO BACTERIOSTATICO Y/O BACTERICIDA DEL EXTRACTO DE GEL DE ALOE VERA 75
Preparacion del inoculo. A partir de un cultivo
original de L. monocytogenes ATCC 7635 de 24
h/overnight, se tomo con una asa de platino y se sembro
en placas de agar nutritivo, incubandose a 35‹C
por un periodo de 4 a 6 horas, para lograr la fase logaritmica.
Posteriormente y a partir de una colonia aislada
se tomo con el asa y se preparo una suspension
con agua esteril, ajustando la densidad de la suspension
del cultivo por comparacion de su turbidez con
un estandar de 0,5 de Mc Farland de BaSO4, mediante
este procedimiento se garantizo un inoculo inicial de
108 UFC/mL de Listeria monocytogenes.
Metodo de difusion en Agar segun Kirby Bauer.
Para esta prueba se prepararon placas de Petri con
agar PALCAM con un grosor de 6 mm en cada placa.
Una vez solidificado el agar, se impregnaron hisopos
esteriles con la solucion de Listeria monocytogenes
ATCC 7635 y se procedio a inocular cada una de las
placas, cubriendo todo el espacio disponible, hasta obtener
una distribucion uniforme de las colonias. Por
otro lado, discos de papel de filtro Watman N‹ 54, con
diametro de 6 mm, y esteriles, fueron impregnados
con las soluciones de concentraciones especificas de
extracto de gel de Aloe vera, previamente preparadas,
y se colocaron en las placas inoculadas anteriormente;
se colocaron cinco (5) discos de concentraciones diferentes
de extracto de Aloe vera por placa inoculada.
Las placas fueron incubadas a 37‹C, se observaron a
las 24 y 48 horas de incubacion. Los halos de inhibicion
alrededor de los discos, fueron medidos con un
vernier tomando dos medidas por cada disco promediandose;
los ensayos se llevaron a cabo por duplicado.
Como patron de referencia, de los
antibiogramas, se utilizaron discos de Ampicilina y
Gentamicina especificos para la inhibicion de Listeria
en concentraciones de 10 ƒÊg respectivamente.
Determinacion del tiempo minimo de inhibicion.
La determinacion del tiempo minimo de inhibicion se
realizo midiendo el crecimiento bacteriano, para ello
se prepararon 7 frascos Erlenmeyer de 50 mL, identificados
del 1 al 7, a cada una se les vertio 10 mL de
caldo nutritivo esteril; seguidamente al frasco No 1 se
le agregaron 10 mL de extracto de Aloe vera al 10%;
al frasco No 2, 10 mL de extracto de Aloe vera al 20%,
y realizando el mismo procedimiento para las concentraciones
30%, 50%, 80%, 90%, 100% respectivamente;
se preparo un frasco control con 10 mL de
caldo nutritivo. Cada uno de los frasco fueron inoculados
con 0,1 mL de suspension de 107 UFC/mL de
Listeria monocytogenesATCC 7635; inmediatamente
se procedio a medir la absorbancia con un espectrofotometro
Thermo Spectronic Genesys UV, a 540 nm
(tiempo 0). Posteriormente los frascos inoculados se
incubaron a 37‹C midiendo la absorbancia a intervalos
de una hora hasta transcurridas 12 horas desde la primera
medicion. Los datos obtenidos fueron graficados
para obtener las curvas de crecimiento respectivas.
Se comparo la curva resultante de cada concentracion
de la solucion de Aloe vera con la curva de 0%, a
fin de evidenciar diferencias significativas en el crecimiento
de Listeria monocytogenes. Todos los experimentos
se realizaron por duplicado.
Concentracion Minima Bactericida. De los frascos
preparados para la prueba de Tiempo Minimo de
Inhibicion, se tomo una asada y se sembro en una
placa de Petri con agar Palcam, se incubaron a 37‹C
durante 24h. Luego de las 24h se observaron las placas
y se selecciono aquella en la que no hubo crecimiento
bacteriano. La concentracion de la solucion de Aloe
vera en la que no hubo crecimiento bacteriano en la
placa fue tomada como la concentracion bactericida
minima.
Analisis de los Datos. Los datos relativos a la formacion
o no del halo de inhibicion microbiologico, asi
como el diametro del halo, fueron por duplicado y se
promediaron. Se procesaron a traves de un analisis
descriptivo (media aritmetica) y se construyeron diagramas
de cajas y aristas (BOX & WHISKER PLOT)
en relacion a la media de los halos de inhibicion obtenidos.
Para determinar cambios en la dinamica de crecimiento
en Listeria monocytogenes, de acuerdo a las
concentraciones del extracto de gel de Aloe vera usadas
en el estudio, se promediaron y se graficaron las
densidades opticas obtenidas, a fin de presentar las respectivas
curvas de crecimiento microbiano, comparando
cada uno de los tratamientos mediante la
aplicacion de la prueba de correlacion de Spearman
(prueba no parametrica) que mide la diferencia entre
una distribucion observada y otra esperada). Los datos
fueron procesados a traves del programa estadistico
STATISTIX 9.0.0.
RESULTADOS
Los resultados obtenidos durante la realizacion de
los ensayos propuestos para evaluar el efecto bacterios76
RAMIREZ MERIDA et al.
tatico y/o bactericida del extracto de gel de Aloe vera
en cultivos de Listeria monocytogenesATCC 7635, en
comparacion con los halos de inhibicion de los patrones
de referencia de antibioticos (0,5 mm), mostraron
que los halos de inhibicion promedio, obtenidos con
las diferentes concentraciones del extracto de gel de
Aloe vera, fueron de 1,5 mm para las concentreaciones
de 10 a 40% respectivamente, asi como de igual magnitud
para las concentraciones 60,70 y 100%, mientras
que se pudo observar una tendencia inhibitoria superior
en la concentracion del 90%, segun se evidencia en la
figura de caja y aristas (Figura 1).
La Figura 2, muestra la curva de crecimiento de
Listeria monocytogenes en condiciones normales de
caldo nutritivo y curvas de crecimiento del microorganismo
en soluciones de Aloe vera a diferentes porcentajes
de concentracion y medidas por densidad optica.
La curva normal de crecimiento sin Aloe vera
(0%), muestra el comportamiento esperado: una fase
de latencia o adaptacion la cual se inicia luego de la
inoculacion del microorganismo culminando aproximadamente
a las 4 horas; seguidamente una fase logaritmica
o exponencial hasta alcanzar su pico
maximo de multiplicacion a las 8 horas de incubacion
para mantenerse en fase estacionaria hasta el final de
las mediciones. Las curvas de crecimiento del microorganismo
a las diferentes concentraciones del extracto
de Aloe vera evidencian un patron de
crecimiento que sigue la tendencia de fase de latencia
que, para las soluciones con concentraciones del ex-
FIGURA 1
Diagrama de cajas y aristas
(BOX & WHISKER PLOT) por
grupo con relacion al diametro
del halo de inhibicion de los
discos en el cultivo de Listeria
monocytogenes en presencia del
extracto de gel de Aloe vera.
FIGURA 2
Curva de crecimiento
bacteriano de Listeria
monocytogenes ATCC 7635,
a diferentes concentraciones del
extracto de gel de Aloe vera.
EFECTO BACTERIOSTATICO Y/O BACTERICIDA DEL EXTRACTO DE GEL DE ALOE VERA 77
tracto de 10, 20 y 30% respectivamente finaliza a las
2 horas, mientras que para las concentraciones de 50,
80, 90 y 100% finaliza a las 4 horas; la fase logaritmica
o exponencial se mantiene desde las 2 horas
hasta las 5 horas para las concentraciones de 10, 20 y
30% y a partir de este momento se mantiene en fase
estacionaria hasta el final de las mediciones realizadas.
Por otro lado, para las concentraciones de 50, 80, 90 y
100% de extracto de Aloe vera la fase logaritmica o
exponencial del crecimiento del microorganismo comienza
despues de 4 horas de incubacion y se mantiene
hasta las 8 horas, con una declinac |
ion leve del
crecimiento, por lo que se puede considerar que entra
en fase estacionaria, y luego continuar un crecimiento
hasta las 11 horas.
DISCUSION
Los resultados obtenidos en la prueba de correlacion
de Spearman, evidenciaron que al comparar la
curva de crecimiento normal respecto a las distintas soluciones
de concentraciones de Aloe vera, existe una
diferencia estadisticamente significativa (p < 0,01). En
la grafica de crecimineto microbiano, resultante de la
aplicacion de Aloe vera, se pueden observar que las tres
fases de crecimiento se lograron en un menor tiempo,
respecto a la curva control (0%). Este comportamiento
pudiera deberse a la presencia de ciertas sustancias contenidas
en el gel de Aloe vera, que pudieron favorecer
el crecimiento de la bacteria, tales como: minerales,
vitaminas, proteinas, iones y como principal carbohidrato,
la glucosa (12). Sin embargo, a pesar de este favorecimiento,
las curvas de crecimientos resultantes
para cada una de las concentraciones de Aloe vera utilizadas,
muestran picos de absorbancias muy por debajo
al obtenido en la curva control, demostrando esto,
que a pesar de que se alcanzo la fase exponencial rapidamente,
las diferentes concentraciones de gel Aloe
vera, interfirio en el crecimiento de Listeria, que pudo
ser debido a la presencia de ciertos factores inhibidores
presentes en el gel (14).
Agary y col. (14), demostraron que el gel del Aloe
vera posee efectos inhibitorios sobre otros microorganismos,
tales como Staphylococcus aureus y Trichophyton
mentagrophytes, efecto que no lograron al
aplicar extractos de la penca sobre los mismos cultivos,
sugiriendo que existen constituyentes del gel de
la penca que no estan presentes en la corteza de la
misma y que tienen un potencial antimicrobiano importante,
no solo para cierto tipos de microorganismos,
sino para diferentes bacterias e incluso hongos, de tal
manera que a lo demostrado en trabajos precedentes,
se une lo logrado en la presente investigacion, al demostrarse
la existencia de una accion bactericida sobre
Listeria monocytogenes.
Adicional al efecto inhibitorio que el gel de Aloe
vera tiene sobre algunos microorganismos, existen trabajos
que reportan efectos positivos de ciertos componentes
purificados de este gel, tal como es el caso
del acemanano, uno de los principales componentes
polisacaridos que estan presentes en el gel de la planta
y que segun investigaciones, permite potenciar la actividad
inmunomoduladora, al incrementar la sensibilidad
de los macrofagos, aumentando la superficie de
expresion molecular (16). Por otra parte, tambien se
ha identificado que dicha sustancia, el acemanano,
tiene la facultad de inhibir la adherencia de
Pseudomona aeruginosa a las celulas epiteliales del
pulmon en humanos (17), por lo que se amplian los
descubrimientos sobre los efectos de este carbohidrato
del que el gel de Aloe vera es tan rico. Si bien el gel
de Aloe vera posee muchos otros componentes, no se
debe dejar a un lado la posibilidad de que el acemanano
sea responsable, entre otras cosas, del efecto bacteriostatico
sobre Listeria monocytogenes, reflejado en
el presente trabajo.
Se pudo demostrar que el extracto del gel de Aloe
vera posee cierto efecto bacteriostatico sobre
Listeria monocytogenes, requiriendo para ello una
concentracion minima de 10% del mismo. Asimismo,
se pudo observar en las curvas de crecimiento
que no se logro un efecto bactericida, por
cuanto en cada una de ellas la bacteria logro desarrollarse
en mayor o menor medida.
El tiempo requerido para observar el efecto inhibitorio
del gel de Aloe vera sobre Listeria monocytoges,
fue de 5 horas para las diferentes concentraciones del
extracto de gel de Aloe vera, con un efecto bacteriostatico
estadisticamente significativo (p<0,01), aunque
el efecto no fue directamente proporcional al aumento
de su concentracion.
Se puede inferir que el gel de Aloe vera tiene potencial
para ser sugerido como biopreservante en la industria
alimenticia, evitando de esta manera la
proliferacion de Listeria monocytogenes, como un patogeno
emergente, con capacidad de afectar a un seg78
RAMIREZ MERIDA et al.
mento importante de la poblacion, principalmente los
mas susceptibles. Se recomienda la realizacion de estudios
donde se lleve a cabo la correlacion de los halos
de inhibicion obtenidos del extracto de gel de Aloe
vera con otros compuestos con capacidad antibacteriana
a diferentes concentraciones, en el que la bacteria
en estudio resulte sensible, para de esta manera discernir
mejor el efecto bacteriostatico de Aloe vera y
tener un marco de referencia comparativo. De igual
forma se sugiere la utilizacion del extracto de gel de
Aloe vera liofilizado, siendo esta una buena alternativa
de concentracion de esta sustancia que pudiera ofrece
mejores y mayores resultados sobre Listeria monocytoges
y demas patogenos alimentarios.
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